中药锁阳三萜类组分通过骨骼肌线粒体解耦联改善高脂粮诱导小鼠肥胖的分子机制研究

Cynomorii Herba is one of the most commonly used “Yang-invigorating” herb in Chinese medicine. Previous studies in our laboratory have demonstrated that pretreatment with methanol extract of Cynomorii Herba induced mitochondrial uncoupling in C2C12 cells. Bioassay-guided fractionation and LC-MS analysis have shown that triterpenoids (ursolic acid and its analogues)-enriched fraction from Cynomorii Herba (namely HCY2) can significantly decrease mitochondrial coupling efficiency in C2C12 cells. Results obtained from animal studies indicated that long-term HCY2 treatment could significantly attenuate high fat diet induced obesity in mice. The anti-obesity effect was associated with the improvement in the obesity related metabolic syndromes, with the possible involvement of mitochondrial uncoupling. However, the biochemical mechanism underlying the aforementioned actions of Cynomorii Herba and the associated signaling pathway(s) remain to be investigated. Here, we endeavor to investigate the biochemical mechanism underlying the Cynomorii Herba-induced mitochondrial uncoupling. The involvement of the AMPK/PGC1-α pathway will also be examined in C2C12 cells and in skeletal muscle. The elucidation of the biochemical mechanism(s) underlying the triterpenoids from Cynomorii Herba should help to establish the molecular basis of anti-obesity effect of Cynomorii Herba.

线粒体解耦联为目前减肥药物开发的研究热点。在我们的前期研究中，结合活性导向分离以及高分辨率液质联用分析发现，锁阳一个以熊果酸、齐墩果酸、锁阳萜及乙酰熊果酸为主要成分的三萜类组分(HCY2)能诱导骨骼肌细胞线粒体解耦联蛋白活性。长期HCY2给药能显著降低高脂粮诱导的肥胖小鼠体重和脂肪重量，并改善肥胖小鼠的血糖耐受程度，高血脂和脂肪肝等相关代谢疾病。本课题拟进一步研究锁阳三萜组分HCY2诱导线粒体解耦联的分子机制，分别从线粒体内膜为作用靶点，线粒体ROS作为信号分子诱导线粒体解耦联以及 AMPK/PGC1-α信号通路等方面进行探讨，并用细胞模型和高脂粮小鼠模型进行验证，从而在分子和细胞水平上解释其减肥药效的作用机制，为防治肥胖及其相关疾病奠定基础。

项目背景： 我们在前期研究中，从中药锁阳中提取到以熊果酸、齐墩果酸、锁阳萜及乙酰熊果酸等三萜类成分为主的活性馏分(HCY2)，发现其能诱导骨骼肌细胞线粒体解耦联蛋白活性。长期HCY2给药能显著降低高脂粮诱导的肥胖小鼠体重和脂肪重量，并改善肥胖小鼠的血糖耐受程度，高血脂和脂肪肝等相关代谢疾病。..主要研究内容：进一步研究锁阳三萜组分HCY2诱导线粒体解耦联的分子机制，分别从HCY2影响线粒体内膜流动性，线粒体ROS作为信号分子诱导线粒体解耦联以及 AMPK/PGC1-α信号通路等方面进行探讨，并用C2C12骨骼肌细胞模型和高脂粮诱导小鼠肥胖模型进行验证，从分子和细胞水平上解释其减肥药效的作用机制。..重要结果及关键数据：用MTT方法检测HCY2对C2C12细胞线粒体电子传递速度的作用，在底物丙酮酸盐与苹果酸盐的共同作用下，HCY2预处理的细胞具有显著的提高线粒体电子传递速度的作用。以上数据表明，HCY2增强线粒体内膜流动性，从而提高线粒体电子传递速度。Clark氧电极法实验数据表明，HCY2预处理细胞能显著增加线粒体三态及四态呼吸速率，并提高线粒体呼吸控制率RCR（三态呼吸速率/四态呼吸速率），当使用抗氧化剂（DMTU）与HCY2共同预处理细胞后，线粒体呼吸控制率RCR升高被抑制，此数据表明HCY2是通过ROS作为信号诱导分子诱导线粒体解偶联。 还用Western Blot方法检测了HCY2预处理对AMPK/PGC1-α信号通路的作用，数据表明，HCY2能增加C2C12细胞AMPK磷酸化程度，从而激活AMPK，同时增加GLUT4，PGC1- α ，MTTFA以及线粒体UCP3和COX的表达。同样用抗氧化剂（DMTU）预处理后，相关蛋白表达量也随之下降至对照组水平。我们进一步用高脂粮肥胖小鼠模型验证了HCY2减肥作用机制，发现HCY2给药激活AMPK/PGC1-α信号通路，为验证HCY2诱导的线粒体解偶联在其发挥减肥药效中的作用，我们采用 KCH与HCY2共同给药，发现KCH能逆转HCY2的线粒体解偶联作用，抑制了HCY2的减肥药效。由此证明，HCY2诱导线粒体解偶联是其发挥减肥药效的重要机制。..科学意义：我们的研究结果能为中药锁阳防治肥胖及其相关疾病奠定基础，并为后期相关产品开发提供科学依据。