外胚间充质细胞维持自我更新与影响牙胚发生的分子机制

Ectomesenchymal cells, deriving from neural crest cells, play a predominant role in odontgenesis process of vertebrates. Yet its' effection in the termination of tooth germ's development is still unclear. Either the cells differentiate totally or partly, after the development of maxilla bone, control the hetero-patterns of tooth developments (termination or persistency) in mammals and reptiles separately. The machanism of ectomesenchymal cells in maitaining self-renewal or shifting differentiation can give base for the diphyodont of mammals, which from the developmental biological view. This project is proceeded from the effect of LIF on ectomesenchymal cells in maintaining self-renewal and odontogenic potency. We'll emphasize in studying the funtion and variation of transmembrane protein gp130 and its downstream signal pathway about JAK-STAT3 accompanied with the self-renewal and differentiation of ectomesenchymal cells. We also will investigate the phosphorylated proteins of second messenger molecule ,what are expressed differently from activation to inhibition. Above these research can we elucidate the linked molecule mechanism in signal transduction and cell differentiation correspondingly. The project is helpful on further idea that how can we control the differentiation process of ectomensenchymal cells of mammals by fetching intervention. Also the creative theory and the exploratory thinking will be provided for the presumption about tooth regeneration in natural development condition.

神经嵴细胞来源的外胚间充质细胞在牙胚发生的启动过程中起重要作用，但是其在牙胚发生的终止过程中的作用尚未能确定。哺乳动物和爬行动物牙胚发生的不同模式提示我们，该干细胞可能在控制牙胚发生终止上起重要作用。该细胞群是全部分化还是保留部分自我更新的干细胞，决定了牙胚发生转入终止或持续进行。研究该细胞维持更新/转入分化的机制，可以从发育生物学角度为诠释哺乳动物仅拥有双牙列提供依据。本项目从LIF维持外胚间充质细胞自我更新及牙向分化潜能切入，着重研究跨膜蛋白gp130及其下游JAK-STAT3信号通路随外胚间充质细胞自我更新/转入分化过程中，胞内第二信使分子的磷酸化蛋白活化/抑制的表达变化及对牙源性上皮增殖的影响，从而阐明相应的信号转导与细胞变化的分子机制，有助于进一步研究在哺乳动物牙胚发生过程中如何干预外胚间充质细胞的分化进程，为实现体内自然发育状态下牙再生的设想提供创新性理论和探索性思路。

神经嵴细胞来源的外胚间充质细胞（Ectomesenchymal cell, EMSC）在牙胚发生的启动过程中起重要作用，但是其在牙胚发生的终止过程中的作用尚未能确定。本项目以哺乳类动物牙列发生自然终止和爬行类动物牙胚发生持续不断的客观现象为切入点，根据已有的研究结果提出假设，认为颌骨内始终有部分EMSC维持自我更新、保持未分化性是成牙持续进行的一个重要原因。应用细胞生物学、分子生物学的多种技术手段研究了EMSC及牙源性上皮细胞增殖和分化的相关信号调控，尤其是JAK/STAT3信号通路对于两种细胞维持自我更新的分子机制。.研究内容包括：.➊原代培养小鼠E14d鼠胚的颌突EMSC，建立LIF促使EMSC维持自我更新的细胞培养模型，对EMSC表面的膜受体gp130进行定性分析，并定量研究在撤除LIF作用下随着EMSC自发分化，其表面gp130减少的趋势。.➋将维持自我更新及出现分化后的EMSC分别与牙源性上皮细胞重组，观察细胞群有无牙向分化，确认EMSC的分化与否和细胞群维持或丧失牙向分化潜能的对应性，并进一步与EMSC膜受体gp130的变化建立关联。.➌在此基础上，对EMSC分化前后胞浆中JAK、STAT3、SHP2、PI3K的基因及相应磷酸化的蛋白表达变化进行研究。确认EMSC由自我更新状态转入分化进程与JAK-STAT3、SHP2-Ras-ERK、PI3K三者的信号通路表达平衡被打破有关。.➍比较EMSC在分化前后与牙源性上皮细胞共培养时，牙源性上皮细胞中JAK、STAT3基因及蛋白的表达变化模式，同时通过添加JAK信号分子的抑制剂，研究人工干预下EMSC分化及牙源性上皮细胞增殖的变化规律。.研究获得了以下创新性成果：.➊建立了小鼠外胚间充质干细胞的分离、纯化、原代培养体系，并对其干细胞特性进行了鉴定。确认了LIF能够维持EMSC保持自我更新能力，随着EMSC细胞转向分化，其表面gp130的表达量逐步下降。.➋分化后的EMSC与牙源性上皮细胞共培养茜素红染色阴性，DSPP和DMP1蛋白表达低于未分化组，显示其成牙能力降低。.➌未分化EMSC细胞胞浆中JAK1和JAK2变化较为明显，呈现持续上升趋势，而未添加LIF的培养基中逐渐分化的EMSC细胞中JAK1和JAK2基因变化不明显。同时，其下游信号分子STAT3在添加LIF培养基保持未分化状态的细胞中持续高表达。.➍添