旋毛虫侵入宿主肠上皮细胞相关因子的筛选与鉴定

旋毛虫病是一种严重的食源性寄生虫病，也是屠宰动物首检和强制性检疫的人兽共患病。旋毛虫幼虫侵入小肠粘膜继续发育或是从肠道排出是能否建立感染的关键。由于幼虫口孔无齿状和矛状结构，幼虫侵入肠上皮细胞很可能不是简单的机械性损伤，目前对幼虫附着与侵入肠上皮细胞的机制尚不清楚。该课题拟应用蛋白质组学与免疫组学从旋毛虫幼虫分泌蛋白与表面蛋白中筛选几种典型的功能蛋白，进行质谱分析、分子克隆、体外表达及纯化，制备重组蛋白与抗重组蛋白抗体，通过旋毛虫幼虫-肠上皮细胞模型及动物实验，筛选出对幼虫侵入肠上皮细胞有明显促进作用的蛋白即为旋毛虫侵入相关因子；应用生化、RNA干扰及免疫组化技术对旋毛虫侵入相关因子的蛋白性质、酶活性、基因功能及部位进行鉴定。该项目为阐明旋毛虫侵入肠粘膜的分子机制、寻找旋毛虫病疫苗的高保护性抗原、研究抗旋毛虫新药及杀虫机制等奠定基础。

本项目将旋毛虫感染性幼虫与大鼠、小鼠肠上皮细胞进行培养，在光镜、荧光显微镜下观察了幼虫对肠上皮细胞的侵入以及在细胞单层中移行与发育情况，成功建立旋毛虫幼虫-肠上皮细胞体外侵入模型。应用SDS-PAGE及Western blotting对旋毛虫肌幼虫经胆汁激活或与肠上皮细胞孵育后幼虫与细胞蛋白的变化进行了分析；应用实时定量PCR对旋毛虫肌幼虫经胆汁激活及与细胞孵育后增加的10个蛋白基因mRNA转录水平进行了观察；应用2-DE、MALDI-TOF/TOF-MS及shotgun LC-MS/MS对旋毛虫幼虫ES蛋白、幼虫与肠上皮细胞培养后增加的虫体蛋白及细胞中的旋毛虫蛋白进行了鉴定与分析。结果表明，在胆汁或细胞刺激下旋毛虫幼虫表达与合成了一些新蛋白（如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、腺苷脱氨酶、5’-核苷酸酶以及烯醇酶等），其中具有水解酶与转移酶活性的一些蛋白酶可进入肠上皮细胞内；这些蛋白酶可能是旋毛虫侵入肠上皮细胞的相关因子。对编码旋毛虫丝氨酸蛋白酶基因TspSP进行了克隆、表达及鉴定，体外与动物实验证实，抗旋毛虫重组TspSP蛋白抗体对旋毛虫幼虫的侵入、移行及发育均有明显的阻断与抑制作用，表明丝氨酸蛋白酶是旋毛虫幼虫的侵入相关因子。免疫复合物在幼虫头端形成的帽样结构可能是阻止幼虫侵入肠上皮细胞的主要机制。