联合中部同序引物对和MALDI-TOF质谱进行多重血流病原菌核酸的直接检测

The rapid and accurate identification of pathogens is the basis for diagnosis and treatment of bloodstream infections. However, only nuclear acids amplification can realize direct detection of pathogens. Core reasons include multiple PCR primers interfere and limited fluorescence channels for detection (fluorescence quantitative-PCR). MALDI-TOF mass spectrometry can detect multiple nucleic acid targets based on multiple PCR, but this method is still limited by interference problems of primers during multiplex PCR. Based on the mass spectrometry platform, our group has successfully established a five-plex reaction system, which can directly detect the nucleic acid of five pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus in one reaction tube and complete the identification within seven hours. Our study intends to use the central homo primers to reduce the interference between multiple pairs of primers to decrease interference of multiplex PCR to the maximum of 13 pathogenic bacteria, which account for 95% of the clinical infections. In addition, this MALDI TOF MS system can simultaneously detect 380 samples on the same chip, which provides a new, direct and rapid identification method for bloodstream infection pathogens.

病原菌快速、准确的鉴定是血流感染诊疗的依据，但目前仅核酸扩增可以完成直接检测。但已有的核酸直检方法可同时检测的病原菌种类较少，核心原因是多重PCR引物干扰严重，且扩增产物检测手段受限（如荧光PCR通道过少）。MALDI-TOF质谱可在多重PCR的基础上进行多核酸目标同时检测，但此方法依然因为前期扩增干扰问题限制了检测种类。对此，本课题组创新性使用中部同序引物对，减少多对引物间相互干扰，已在无引物干扰的情况下完成多重核酸扩增。同时，课题组此前基于质谱平台，已成功建立一种5重反应体系，可在一个反应内直接检测金黄色葡萄球菌等五种病原菌的核酸，7小时内完成鉴定。本研究拟在此基础上，结合中部同序引物对的使用，拟提高多重PCR检测种类上限至13种病原菌,覆盖13种占临床95%感染率的病原菌；利用质谱平台，同时一张质谱芯片可以检测380份样本，为临床提供一种全新的血流病原菌直接快速鉴定方法。

病原菌快速、准确的鉴定是血流感染诊疗的依据，但目前血流感染诊断的金标准为血培养，耗时长且阳性率较低，核酸扩增可以完成直接检测。但已有的核酸直检方法可同时检测的病原菌种类较少，核心原因是多重PCR引物干扰严重，且扩增产物检测手段受限（如荧光PCR通道过少）。MALDI-TOF质谱可在多重PCR的基础上进行多核酸目标同时检测（核酸质谱），但此方法依然因为前期扩增干扰问题限制了检测种类。本课题创新性使用中部同序引物对组合普通引物优化的手段，减少了多对引物间相互干扰，建立了基于中部同序引物对和核酸质谱技术的检测体系，整体检测时间6-8小时。.检测体系由细菌检测系统和真菌检测系统两部分组成，分别针对七种和五种血流感染常见的病原菌，前者包括大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、屎肠球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌，后者包括白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌。在多重PCR扩增阶段，不同细菌所使用的中部同序引物对经过染料法qPCR验证，相比普通随机引物的Ct值可推迟出现6-10个循环；真菌使用了通用引物ITS1和ITS4进行扩增。同时，课题对不同的病原菌设计了单碱基延伸引物，经过优化选择，可避免非特异延伸。.在此基础上，对所建立的检测系统开展了特异度、灵敏度、变异株测试、携带污染测试、重复性测试等性能验证。结果表明所建立检测体系可避免其他菌株干扰，灵敏度可达10-150CFU/ml，稳定性强，可应对临床血液样本病原菌浓度低、变异株多的复杂条件。对于临床样本验证，细菌检测系统检测了临床样本150例，与金标准相比，灵敏度为97.82%，特异度为 97.11%，阳性预测值为93.75%，阴性预测值为99.01%；真菌检测系统检测临床样本108例，与传统方法相比，灵敏度为94.74%，特异度为97.14%，阳性预测值为92.31%，阴性预测值为98.55%，细菌与真菌的检测结果与传统金标准方法相比一致性好（kappa>0.8，p>0.01）。.本课题针所建立的检测体系，为临床提供了一种全新的血流病原菌直接快速鉴定方法，可大幅度降低患者的诊疗成本。