rapsyn蛋白泛素化修饰在神经肌肉接头发育中的功能和信号机制研究

Neuromuscular junction (NMJ) is a specialized chemical synapse that forms between motor axon terminals and skeletal muscle fibers. Scaffold protein rapsyn plays a critical role during the NMJ development and maintanence. It shows that rapsyn turnover at AChR clusters is even faster, with a halftime of approximately 1-1.5 hr. Our previous work demonstrates that HSP90β regulates agrin-induced AChR clusters formation by regulation of rapsyn turnover. Our latest studies demonstrated that high autoubiquitination modification of rapsyn was detected in vivo. In addition, an E3 ligase CHIP, which shows high-affinity with HSP90β, is well colocalized with postsynaptic AChR clusters at the NMJ. Therefore, in this proposal we sought to further investigate the biological function of rapsyn ubiquitination during the development of the NMJ. Moreover, we will investigate the regulatory role of E3 ligase CHIP in the process of rapsyn ubiquitination modification, as well as its function and the signaling mechanisms in the NMJ development. Therefore, this research proposal will provide experimental evidence to further understand the molecular mechanisms during the development of the NMJ.

神经肌肉接头是运动神经元轴突末梢在骨骼肌纤维上形成的一种特化的化学突触。细胞脚手架蛋白rapsyn在神经肌肉接头发育和维持过程中发挥着关键性作用。其具有快速的周转代谢过程，在肌细胞的半衰期通常仅为一至数小时左右。我们前期的工作研究发现HSP90β可通过稳定rapsyn蛋白的周转代谢调节agrin诱导的AChR聚集簇的形成。我们最近的研究发现rapsyn蛋白能够发生高度的自我泛素化修饰，而且，同HSP90β蛋白具有高度亲和力的E3连接酶CHIP能够同神经肌肉接头簇的突触后膜AChR聚集簇共定位。因此，本研究旨在进一步探讨在神经肌肉接头发育过程中rapsyn蛋白泛素化修饰的生物学功能，并探讨E3连接酶CHIP在rapsyn泛素化过程中的调节作用及其在神经肌肉接头发育中的功能和信号转导机制。从而，为深入理解神经肌肉接头发育的分子机理提供实验依据。

突触后膜脚手架蛋白rapsyn在神经肌肉接头突触发育和功能维持过程中发挥关键性调节作用。本工作是在前期已有的工作基础上,重点探讨了rapsyn蛋白泛素化修饰的特征、生物学功能及可能的信号机制。工作结果总结如下：1、rapsyn蛋白在体内可发生高度自我泛素化修饰，RING-H2结构域中384位组氨酸位点的突变或392-402位氨基酸序列的缺失突变并不影响rapsyn蛋白的自我泛素化修饰。2、rapsyn蛋白体外泛素化修饰显示rapsyn蛋白不能被E2连接酶UbcH3、UbcH5A、UbcH5B、UbcH5C、UbcH6和UbcH7所催化，进而发生自我泛素化修饰。但该反应体系中UbcH5C可催化E3泛素连接酶CHIP发生极强的自我泛素化修饰。3、GST-pull down实验表明rapsyn蛋白可同E3泛素连接酶CHIP相互作用，该相互作用依赖于rapsyn蛋白N端的TPR重复结构域。4、Co-IP实验表明rapsyn同CHIP之间的相互作用依赖于其N端的TPR结构域，CHIP突变体CHIP(K30A)既不能同HSP90β相互作用亦不能同rapsyn相互作用，进一步表明HSP90β参与并介导了CHIP同rapsyn之间的相互作用。5、α-BTX Pull down实验证实CHIP可能参与了rapsyn蛋白介导的AChR聚集簇形成过程。6、在肌细胞中特异性敲低CHIP表达能够逆转敲低HSP90β导致的rapsyn稳定性减低。7、功能学实验研究表明，在肌细胞中特异性敲低CHIP表达能够“挽救”HSP90β敲低导致的AChR聚集簇解聚现象的发生。8、在原工作计划的内容之外，我们还成功制备了骨骼肌特异性rapsyn及其RING结构域缺失型转基因小鼠（分别表示为HSA-rapsyn和HSA-rapsynΔRING），用于下一步的体内功能挽救实验。并在此工作基础上，获得了国家基金委面上项目延续资助。