小胶质细胞活化和极化在锰致多巴胺能神经元损伤中的作用

Environmental neurotoxicant manganese (Mn) is well known as one of the causes for Parkinson’s disease. Microglia activation participate the progress of dopamine neuron damage. Microglia can be activated by Mn and damaged neurons. Then activated microglia is polarized to type of M1 and M2 by signal pathway. In our previous study, we find that Mn can regulated the level of TLR4、JAK、Arg1、Ym1 mRNA for microglia M1/2 markers. However, it is unclear that distribution of activated microglia, the mechanism of microglia activation and polarization to M1/2. In this project, we will investigate the distribution of activated microglia in the brain of C57BL/6 rats exposed to Mn, and observe the mechanism of microglia activation and polarization to M1/2 using co-culture system with BV2 cells and MN9D cells exposed to Mn separately. The level of PI3K, TLRs, Notch, JAK,STAT, TNFα, IL-1β, Yml, Arg1, CD206 will be detected using Western blotting and real time RT-PCR. This project will provide new idea and innovation strategy for prevention and treatment of Mn-neurotoxicity and Parkinson’s disease.

环境毒物锰引起的多巴胺能神经元损伤被认为是帕金森病的原因之一，小胶质细胞（MG）的激活参与了神经元损伤的过程。MG可以被锰直接激活，也可由锰损伤后的神经元释放炎性信号所激活。激活后的MG可以向致炎型M1或抗炎型M2极化。我们前期研究发现，锰可以影响M1/2标志物TLR4、JAK、Arg1、Ym1等基因表达。激活的MG在脑区的分布、锰激活MG及诱导其极化的分子调控机制尚不清楚。本研究拟利用C57BL/6小鼠纹状体立体定位染锰，观察MG在脑区的分布、激活及M1/2极化情况；在Transwell共培养体系中分别染毒MG细胞系BV2和多巴胺能神经细胞系MN9D，通过检测PI3K、TLRs、Notch、JAK、STAT等信号通路及TNFα、IL-1β、Yml、Arg1 、CD206等极化标志物表达，观察调控MG激活和M1/2极化的分子机制。该研究对锰神经毒性及帕金森病的防治提供了新的思路和策略。

锰是机体必需微量元素，也是常见的环境与职业毒物。随着我国钢铁工业和汽车产业的发展，生活和职业环境锰污染带来的健康危害日趋严重。机体长期过量暴露于锰环境可造成多巴胺能神经元的损伤，近年来研究发现，在锰导致的多巴胺能神经元损伤过程中，小胶质细胞的激活和极化发挥了重要作用。小胶质细胞激活与细胞内的信号转导通路有关如PI3K/Akt通路，细胞自噬参与了小胶质细胞激活和炎症反应。本研究利用动物整体实验和细胞培养来探讨“小胶质细胞激活和极化在锰致多巴胺能神经元损伤中的作用”。主要研究结果发现（1） MnCl2致SH-SY5Y细胞毒性呈剂量效应与时间效应关系。将SH-SY5Y细胞分别暴露于125、250、500、1000 μM MnCl2染毒24 h，随着染毒浓度的增加，细胞存活率呈明显的下降趋势。将SH-SY5Y细胞暴露于250 μM MnCl2分别染毒2、4、6、8、12、24 h，随着染毒时间的增加，细胞存活率呈下降趋势。（2）MnCl2可致SH-SY5Y细胞线粒体自噬。低浓度MnCl2可激发SH-SY5Y细胞发生自噬，自噬标志性蛋白LC3发生明显的LC3-Ι向LC3-II转变、Beclin-1在4 h处表达量达到最大、p62蛋白随着时间的增加表达量逐渐减少。（3） FOXO3在MnCl2致SH-SY5Y细胞线粒体自噬。SH-SY5Y细胞暴露于250 μM MnCl2分别染毒2、4、6 h，同时siFOXO3+Mn暴露的研究显示，FOXO3低表达对线粒体自噬起抑制作用，另外研究发现MnCl2 在诱导自噬的过程中促进FOXO3核滞留。（4）锰染毒不同时间对BV2细胞M1/M2变化的影响。TNF-α为常见的炎性因子，可作为M1表型标志物；Arg1可作为M2表型标志物。用100μmol/L的MnCl2处理BV2细胞，结果显示，随着染毒时间延长，细胞TNF-α的表达总体呈上升趋势，Arg1总体呈先上升后下降趋势。（5）miR-138-5p下调可靶向激活组蛋白脱乙酰酶1（SIRT1）促进锰诱导的细胞自噬。随着MnCl2染毒剂量的增加，SIRT1蛋白的表达逐渐上升，说明MnCl2处理后可以激活SIRT1蛋白的表达，用SIRT1特异性的激活剂SRT1720和抑制剂EX527预处理细胞，表明SIRT1激活或抑制后可以增加或减少自噬。本研究成果对于阐明神经退行疾病的分子机制具有重要的理论意义