PRMT2β丝氨酸磷酸化抑制乳腺癌细胞生长增殖的机制研究

PRMT2β is an alternatively spliced variant of PRMT2, newly identified by the applicant. Our preliminary studies show that this PRMT2β variant has different genomic structure and protein sequence from the wild type PRMT2. Upregulation of PRMT2β significantly inhibits the growth and proliferation of breast cancer cells MCF7. The analysis of biological informatics suggests that the function of cell growth suppression of PRMT2β may be ascribed to the potential of serine phosphorylation at its C-terminus. This study is aimed to clarify the role of PRMT2β serine phosphorylation in ERα-mediated cell proliferation using MCF7-miRNA-PRMT2 cell lines already established. We will determine the effect of PRMT2β expression on the growth and proliferation of MCF7 cells in vitro, define the role of phosphoserine phosphatase in serine phosphorylation, identify the serine phosphorylation sites at the PRMT2β C-terminus, and finally define the key role of serine phosphorylation in ERα target gene expression, cell proliferation in vitro, and tumorigenesis in vivo. The study results will clarify the role and molecular mechanism of the PRMT2β variant in cell growth and tumorigenesis.

PRMT2β是申请者新克隆的乳腺癌相关基因PRMT2的新剪接体。我们前期的工作显示：PRMT2β具有与野生型不同的基因组结构和蛋白质序列，上调其表达能显著抑制MCF7细胞增殖。生物信息学分析表明PRMT2β抑制细胞增殖可能与其C端潜在的丝氨酸磷酸化位点有关。为进一步明确PRMT2β的丝氨酸磷酸化位点在ERα所介导的细胞增殖中发挥的作用，本项目拟选用已建立的MCF7-miRNA-PRMT2细胞系为研究对象，观察PRMT2β高表达对MCF7细胞生长增殖的影响；检测磷酸丝氨酸磷酸化酶对PRMT2β丝氨酸磷酸化的作用，鉴定PRMT2β蛋白C端发挥关键作用的丝氨酸磷酸化位点；分析PRMT2β定点突变对ERα靶基因及细胞生长增殖与裸鼠成瘤的影响，探明PRMT2β剪接体在细胞生长增殖中的作用与机制。该项目的顺利完成，可为明确PRMT2β在肿瘤中的作用与分子机制提供新的实验依据。

PRMT2β是申请者新克隆的乳腺癌相关基因PRMT2的新剪接体，上调其表达能显著抑制乳腺癌MCF7细胞增殖。为了明确PRMT2β在肿瘤细胞增殖中的作用与分子机制，本研究选用已建立的MCF7-miRNA-PRMT2细胞系，采用慢病毒载体构建及感染，荧光定量PCR，Western blot，MTT检测，细胞克隆形成实验，裸鼠成瘤实验，细胞凋亡检测，磷酸化抗体芯片技术，荧光素酶报告基因检测，Chip，EMSA，Transwell实验，细胞迁移等实验方法及技术对比研究野生型PRMT2与新剪接体PRMT2β的生物学功能及作用机制。我们发现：1. 慢病毒载体Tet-on系统稳定乳腺癌MCF7细胞株成功构建，在四环素诱导下，能够稳定高表达PRMT2与PRMT2β；2. 四环素诱导PRMT2与PRMT2β高表达均能够明显抑制MCF7细胞增殖，克隆形成，软琼脂集落形成，促进细胞凋亡，细胞周期受阻于G0/G1期, 但野生型PRMT2作用更明显；3. 四环素诱导PRMT2β高表达能够明显抑制裸鼠移植瘤的大小和体积；4. PRMT2基因可能通过与ERα竞争性结合AP-1位点而抑制细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达。剪接体PRMT2β同样能结合到cyclin D1启动子区的AP-1位点，可能通过竞争性作用减弱野生型PRMT2对pGL4.1-cyclin D1活性的影响从而抑制乳腺癌细胞增殖。除此之外, PRMT2还可通过抑制Akt和Gsk3β的磷酸化而抑制乳腺癌细胞增殖；5. 四环素诱导PRMT2与PRMT2β高表达均能够明显影响乳腺癌MCF7细胞的侵袭转移能力。上述研究结果证实，野生型PRMT2通过ERα-Cyclin D1和PI3K-Gsk3β磷酸化激酶途径抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖，而PRMT2β则主要通过竞争性减弱野生型PRMT2对cyclin D1活性的影响从而抑制乳腺癌细胞增殖。