miR-34家族在人胚胎干细胞向神经细胞定向分化过程中的调控机制研究

MiR-34 family are regulated by p53 and act as tumor suppressors in many cancer cell lines. Recently, several studies shown that they also play important roles in neural system in Drosophila and mouse. But their roles in human neural system are unknown. Base on a neural differentiation system derived from human embryonic stem cells (hESCs) in vitro, we performed miRNA profilings using Solexa sequencing on key time points during neural induction, and found that miR-34s are enriched in the quasi-intermediate state(neural precusor cells). It suggests that miR-34 family may have certain effect on neural conversion. Interestingly, the expression pattern of three miR-34 members are also different on time sequence and expression levels. So we plan to investigate the regulation of miR-34s' expression and their functions on neural differentiation from hESCs in this project.

MiR-34家族是一类功能十分重要的miRNA分子。早期研究表明它们受p53调控并具有抑癌作用。在果蝇、小鼠等物种中的最新研究则表明：miR-34家族在神经系统中具有延缓神经退行性病变和促进神经前体细胞分化的作用。在对人的研究中虽然只局限于神经母细胞瘤中的初步分析，但结果提示我们miR-34家族在人的神经系统中也具有重要作用。为了克服实验材料上的限制，我们已经建立了人胚胎干细胞体外神经分化体系，并通过神经分化过程关键时间点的miRNA表达谱测序，发现miR-34家族主要在神经前体细胞阶段富集，各成员的表达时序性和表达量不同，提示其可能存在表达调控和功能上的差异。因此，本项目将采用DNA甲基化检测、慢病毒转染、流式分析和靶基因验证等技术手段阐明miR-34家族各成员是否存在表达调控和功能上的差异，探讨miR-34家族对人的神经分化过程的影响，并寻找它们作用的关键靶基因从而阐明其调控机制。

利用人的胚胎干细胞体外神经分化体系来研究 miR-34 家族的功能，这在以往的研究中还没有报道过。本项目证明了神经分化过程中 miR-34b/c 为共同转录，成功构建了 miR-34a/b/c 过表达的慢病毒载体，并在肿瘤细胞系中检测了过表达效果；通过慢病毒感染实现神经分化过程中各阶段细胞的 miR-34s 过表达，并通过神经分化各阶段表面标志变化检测发现在神经分化中期，miR-34a 和 miR-34b 的过表达对神经干细胞的维持具有一定的促进作用，而miR-34c 的作用则和对照组无差别。 在神经元出现的早期（30 天左右），慢病毒感染的细胞分化滞后，并不呈现典型 的神经元结构。通过长期的诱导神经分化（超过 100 天）， miR-34c 的过表达对于分化成神经元具有一定的促进作用。 本项目的研究结果系统的阐述了 miR-34 家族各成员在神经分化中的作用， 填补了在这一领域的知识空白，miRNA 作为新兴的小分子药物靶点，在医疗领域已经有成功的应用，这一研究成果对 miR-34 在神经相关营养及疾病领域的应用提供了理论依据。