维药石榴花多酚抑制高糖诱导血管内皮功能障碍及机制研究

Diabetic vascular complications (DVC) is a leading cause of death in diabetic patients.At present China has the highest prevalence of diabetes in the world , and the incidence of young people is increasely growing.Prevention of DVC become imperative.Diabetic vascular disease is considered to be a series of molecular changes including NO bioavailability decreased,active oxygen accumulation and impaired endothelium-dependent vasodilation ,the changes are induced by disturbed synthesis and release of vasoactive substances in vascular endothelial cells under high glucose or high lipid environment.According to our previous study on the traditional Uygur medicine pomegranate flowers, the pomegranate flower polyphenols are effective on reduction in fasting blood and insulin resistance level of diabetic rats, also has a protective effect on endothelial function.Therefore, we designed this study to discuss the mechanism of the protective function of pomegranate flower polyphenols on high-induced endothelial cells from HUVECs、model rats and isolated blood vessels respectively and role of AMPK-eNOS pathway in this process.To provide the theoretic basis for development and utilization of the old glucose-lowering vegetable drug in protection of DVC .

糖尿病血管并发症（DVC）是导致糖尿病患者死亡的主要原因，目前我国是糖尿病患者最多的国家，且青少年发病率也在日益增长。控制预防DVC的发生迫在眉睫。糖尿病血管病变目前认为是在高糖或高脂环境下，血管内皮细胞合成和释放血管活性物质的平衡打乱，引发包括血管内皮NO生物利用度下降、活性氧积聚和内皮依赖性血管舒张功能受损等一系列分子改变。在我们前期对传统维药石榴花多酚提取物的研究中发现，石榴花多酚不仅可有效降低糖尿病大鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗水平，对血管内皮功能也有一定的保护作用。据此，我们设计此项目，分别从HUVECs、动物及离体血管等三个不同层面研究石榴花多酚对高糖诱导血管内皮的保护作用及AMPK-eNOS通路在高糖诱导血管内皮损伤机制中的作用。为开发利用这种古老的降糖药材对糖尿病血管并发症的防治作用提供理论依据。

按照申请书的研究内容，研究工作分为四个主要部分：.第一部分 采用HPLC-QTOF-MS/MS 法测得石榴花多酚含有14种化合物及其特性。包括鞣花酸及其衍生物，石榴皮亭A和B，没食子酸，槲皮素和山奈酚等；.经高效液相色谱法测定，提取自新疆和田地区石榴花的PFP中没食子酸含量为1.91 mg/g，鞣花酸含量为12.09 mg/g。.第二部分：体外血管实验.1.采用离体血管环灌流法观察PFP对大鼠胸主动脉环张力的影响, PFP（100~900mg/L）具有内皮依赖性舒张作用，且具有浓度依赖性。通过采用各K+通道阻断剂和eNOS抑制剂 L-NAME预处理，发现其机制可能与K+通道激活、抑制外钙内流和抑制胞质内钙释放以及促进NO合成有关。而低浓度（0.1～10mg）的PFP能够抑制高糖诱导的血管内皮依赖性舒张功能损伤，其机制可能与PFP激动内皮细胞上M受体，增加NO的产生有关。.第三部分： 细胞实验.高糖诱导人脐静脉内皮细胞后，经PFP和鞣花酸，没食子酸干预，均可以提高其增殖率，其中1 µg/ml 的石榴花多酚，10 µg/ml 的鞣花酸和没食子酸作用48小时均有良好的增殖作用。.第四部分：动物实验.1.在体实验中，采用高脂饲料喂养载脂蛋白E缺失（ApoE-/-）小鼠8周，建立动脉粥样硬化小鼠模型；140mg/kg的石榴花多酚灌胃模型小鼠8周后，HE染色法和电镜观察主动脉病理改变；免疫组化实验观察血管壁中巨噬细胞以及合成型血管平滑肌细胞数量的改变；结果显示石榴花多酚 能够有效减少动脉粥样硬化斑块的形成，改善As病变斑块中巨噬细胞的聚集，显示出良好的抗As 发生发展的作用。其机制可能与调节巨噬细胞源性炎症反应相关基因NF-κB、ICAM-1和CD36 mRNA的表达有关，并再次证实石榴花多酚能够上调eNOS mRNA表达。.2.通过腹腔注射STZ（40mg/kg）加高脂饲料喂养制备糖尿病SD大鼠模型，经PFP干预4周后，PFP高剂量组（150mg/kg）能够有效降低糖尿病大鼠血糖，不同剂量石榴花多酚（50,100,150mg/kg）对糖尿病大鼠的血管舒张作用具有一定的浓度依赖性。此作用主要通过主动脉内皮介导，而对血管平滑肌本身的舒张作用无明显影响。