靶向Legumain抗体-蒜酶偶联物原位释放大蒜辣素前药系统的制备及抗肿瘤活性研究

The Legumain is a lysosomal proteinase. It has been reported to be overexpressed in the majority of human solid tumors. Legumain should be an ideal candidate anti-tumor target. Allicin, a highly active component from freshly crushed garlic, is the interaction product of alliin with the enzyme alliinase. Allicin was shown to be toxic in various mammalian cells in vitro. But its unstability makes allicin difficult to be a drug alone. We will make use of this cytotoxicity to develop a novel approach to cancer treatment, based on site-directed generation of allicin. Alliinase will be chemically conjugated to a mAb of Legumain directed against a specific tumor. After the mAb-alliinase conjugate is bound to target tumor cells, the substrate, alliin, will be added. In the presence of alliin, tumor-localized alliinase will produce allicin, which should effectively kille tumor cell. In order to asses the targeting of mAb-Allinase conjugate，the confocal laser scanning and noninvasive bioluminescent imaging technologies will be utilized in vitro and in vivo. The mAb-allinase / Alliin prodrug system provide a new approach for developing a high antitumor activity of allicin preparation.

Legumain 是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在多种实体瘤高表达，是抗肿瘤靶向药物的理想靶标。大蒜研碎时蒜氨酸与蒜酶相遇产生大蒜辣素，大蒜辣素具有抑制肿瘤细胞生长作用，但不稳定性造成其成药困难。本项目提出将Legumain的抗体与蒜酶偶联，偶联物定向肿瘤后，再给予蒜氨酸，在肿瘤组织与蒜酶原位反应释放大蒜辣素，产生抑制肿瘤生长作用。体外采用Legumain高表达的4T1小鼠乳腺癌细胞，体内采用接种的乳腺癌模型动物，先给予偶联物，再给予蒜氨酸，评价其抗肿瘤活性。同时用荧光标记偶联物评价其靶向性，体外采用激光共聚焦技术评价荧光标记偶联物与肿瘤细胞亲合性，活体动物成像评价荧光标记偶联物在模型小鼠体内的肿瘤靶向性和组织分布。项目提出的Legumain的抗体-蒜酶偶联物与蒜氨酸的前药系统，使得大蒜辣素能在肿瘤组织高度聚集，充分发挥其抗肿瘤活性，为大蒜活性成分高效抗肿瘤药物的研制奠定基础。

Legumain 在实体瘤高表达，是抗肿瘤靶向药物的理想靶标。叶酸受体(folate receptors，FR)是一种肿瘤相关蛋白，在正常组织中的表达高度保守，具有较高肿瘤组织特异性，可与叶酸结合。大蒜辣素具有抑制肿瘤细胞生长作用，但不稳定、易分解使其成药困难。本项目采用多种合成路线分别将Legumain的抗体、叶酸与蒜酶偶联，优化的偶联物具有肿瘤靶向性，并保留蒜酶活性。给予蒜氨酸，在肿瘤组织与蒜酶偶联物原位反应释放大蒜辣素，产生抑制肿瘤生长作用。 通过本项目资助，建立了蒜酶提取物分析方法，为后续蒜酶的进行一步纯化，建立了质控方法。建立了Legumain抗体-蒜酶偶联物合成方法，并创新提出以免疫层析技术建立靶向性筛选的方法，替代传统的细胞靶向性筛选，节省财力和时间。在体外细胞实验中，通过激光共聚焦和流式细胞仪证明Legumain抗体-蒜酶偶联物、叶酸-蒜酶偶联物具有靶向Hela细胞的特性，MTT实验显示Legumain抗体-蒜酶偶联物、叶酸-蒜酶偶联物与蒜氨酸反应原位生成大蒜辣素，产生细胞生长抑制作用。细胞水平实验结果显示叶酸-蒜酶偶联物优于Legumain抗体-蒜酶偶联物，故在动物实验中，以裸小鼠进行宫颈癌肿瘤细胞动物模型实验，结果显示叶酸-蒜酶偶联物联合蒜氨酸组能够明显抑制动物肿瘤的生长。本项目发表学术论文9篇，其中SCI收录1篇，撰写2篇英文，待投SCI收录杂志；申请国家发明专利5项，培养研究生3名。后续，将优化并放大叶酸-蒜酶合成量，设计给药途经，研究体内处置过程，推进成药性研究。