黄瓜miRNAs在啤酒花矮化类病毒(HSVd)致病中的作用研究

Viroids are the smallest known plant pathogenic microbes. Because of their very small size, their autonomous replication, and lack of any viroid-specific polypeptides, they have been made as simple model systems for some studies of microbiology. Thus, identification of viroid pathogenesis would provide insights as to interaction between pathogenic microbes and their hosts. Gene silencing has been found to be associated with viroid pathogenesis, but the mechanism of which remain to be understood. The mechanism may be related to miRNA-mediated gene silencing pathway in the host. About this pathway, only several miRNAs were identified from PSTVd-infected tomato plants, and the relationship of these miRNAs with the expressed symptoms is not clear. In this study, we will identify the host miRNAs and genes that are closely associated with the obvious symptoms showed on HSVd infected cucumber plants using sRNAs and transcriptome analysis. Functions of the identified miRNAs and host genes will be validated by artificial miRNAs experiments in a transient expression system and virus-induced gene silencing (VIGS) system, separately. Thus, the relevance from miRNAs to symptoms expression will be established. Moreover, the regulation of HSVd-derived small RNAs (vdsRNAs) to miRNAs will be identified using the transgenic cucumber plants that only expressed vdsRNAs but not HSVd genomic RNAs. The obtained results can disclose the causal relationship between vdsRNAs and miRNAs. In total, the data of this research will provide novel insights to viroid pathogenesis.

类病毒是已知的最小植物病原微生物，是微生物学有关研究的模式，其致病机制研究可为深入理解病原微生物与寄主互作提供借鉴。基因沉默是类病毒致病的一种重要机制，但具体调控路径尚不清楚。一种可能的调控路径是：类病毒→miRNAs→基因表达→寄主生长发育异常→症状。关于此调控路径，目前仅鉴定出几种相关的寄主miRNAs，并且他们与症状之间的关联仍不明确。本项目以啤酒花矮化类病毒(HSVd)/黄瓜组合为实验系统，利用转录组测序和病毒诱导基因沉默(VIGS)等技术，鉴定与症状直接相关的黄瓜基因及miRNAs，并验证其功能，从而建立调控路径中miRNAs到症状之间的关联。此外，通过转基因获得只表达HSVd的小RNAs(vdsRNAs)而不表达其基因组RNA的黄瓜植株，分析vdsRNAs对黄瓜miRNAs产生的影响，由此建立调控路径中类病毒与miRNAs的联系。研究结果将为类病毒致病机制的揭示提供新线索。

类病毒是已知的最小植物病原物，是微生物学有关研究的模式，其致病机制研究可为深入理解病原微生物与寄主互作提供借鉴。基因沉默是类病毒致病的一种重要机制，但具体调控路径尚不清楚。一种可能的调控路径是：类病毒→miRNA→基因表达→寄主生长发育异常→症状。关于此调控路径，目前仅鉴定出几种相关的寄主miRNA，并且他们与症状的关联仍不明确。本项目将啤酒花矮化类病毒(HSVd)的两个序列变体HSVd-h和HSVd-g54分别接种黄瓜，在接种后第2天、第14天和第28天，分别采集黄瓜叶片，进行小RNA测序和转录组测序。通过生物信息学分析，系统鉴定出了2500多个差异表达的黄瓜基因和30多个差异表达的miRNA。差异表达的基因主要与光合作用、激素信号转导、植物/病原互作等通路相关。其中，光合作用通路相关基因尤其是编码天线蛋白的基因的下调表达以及赤霉素合成及代谢通路基因的差异表达可能与接种黄瓜的叶片皱缩和植株矮化等症状紧密相关。差异表达miRNA具有显著的时间特异性。无论是接种HSVd-h还是HSVd-g54，在接种后第2天，几乎没有差异表达miRNA。在接种后第14天，仅有10个左右的差异表达miRNA。而在接种后第28天，差异表达的miRNA多达34个。这说明HSVd侵染对黄瓜miRNA表达的影响主要表现在侵染的后期。此外，差异表达miRNA也具有类病毒序列变体特异性，因为HSVd-h和HSVd-g54的侵染所引起的差异表达miRNA互有不同。在接种后第14 天和第28天，两者之间分别有4种和12种相同的miRNA。其中，一种新的miRNA，不仅在这两个时间点，而且在两种序列变体侵染的样品中，均呈上调表达。该miRNA与草莓的fve-miR3627a同源。此外，在接种后第14天时，cme-miR172f、-miR169b和-miR169m在两种变体侵染的样品中也呈上调表达，这可能与症状表现相关。以上研究结果不仅确认了类病毒侵染对寄主miRNA表达的影响，而且揭示出了类病毒侵染调控寄主miRNA表达的模式。此外，与寄主症状相关的miRNA的鉴定为进一步揭示类病毒的致病机制提供了新的思路和线索。