基于CD44受体靶向的透明质酸自组装胶束型纳米粒抗肿瘤siRNA传递系统的构建和评价

CD44在肿瘤细胞具有较大分布，低分子量透明质酸（LMHA）与CD44有特异亲和性，可以对肿瘤产生靶向性。本项目以精胺和脂肪胺修饰LMHA,构建siRNA非病毒载体。本项目以针对环氧化酶-2的siRNA为模型基因，评价载体对肿瘤的siRNA转染效率，并通过研究对肿瘤的抑制作用，考察其有效性，通过在体成像和药动学研究评价载体对肿瘤的靶向性。本项目中的载体构建旨在利用LMHA对肿瘤细胞的靶向性，达到靶向性传递siRNA。精胺修饰旨在提高载体结合siRNA的能力，可以增加LMHA的正电荷，使之产生质子海绵效应。脂肪胺修饰后的产物具有两亲性，在水中可自组装成胶束型纳米粒，可以有效保护siRNA，防止降解，由于纳米粒的壳结构由粘度大的透明质酸组成，其稳定性更好。该载体具有生物降解性，刺激性性小，生物相容性高，本项目具有一定的研究工作基础，故可望形成具有一种对肿瘤具有靶向性的高效能的siRNA载体。

本论文将通过改变脂肪胺的碳链长度、透明质酸(HA)分子量和精胺取代度，合成不同脂肪胺和阳离子精胺修饰的透明质酸胶束，研究载siRNA的透明质酸胶束载体的理化性质，评价该载体对肿瘤的体内外靶向性，为高转染率、低毒性的基因载体的设计提供研究方法。本论文的主要研究内容如下： .1、首先筛选出具有特异性沉默COX-2表达的siRNA序列，抑制效果检测结果表明所构建的siRNA954能使编码COX-2的mRNA表达明显降低，抑制率为55.84%，存在显著性差异。而内参β-actin mRNA的表达未受影响。Western blot方法检测到细胞中COX-2蛋白含量也明显降低，而内参β-actin 蛋白的表达未受影响。2、利用酰胺键共价连接精胺（SP）到不同分子量的HA上制备阳离子化的HA（HASP），然后在HASP未修饰的羧基末端上连接不同碳链长度的疏水性脂肪胺，制备出疏水改性的阳离子型透明质酸（HAPL9600/HAPL23000/ HAPL45000/HAPO9600/HAPD9600，统称HAPs），从而使之在水中能形成胶束样结构。各HAPs的表面均带正电，有利于与带负电的siRNA结合，证明疏水阳离子改性已经成功。3、主要对siRNA阳离子型透明质酸胶束的制备工艺和质量评价进行研究。采用转染效率为评价指标来优化载siRNA的HAPs胶束的处方工艺，考察了对载siRNA的HAPs胶束工艺有显著影响的因素，为设计具有高转染率的新型非病毒阳离子基因载体提供依据。4、初步考察了透明质酸胶束在胃癌肿瘤细胞中的靶向效果并初步研究了在SGC-7901胃癌细胞株中的摄取机制，摄取与转染效率之间的关系以及在SGC-7901胃癌细胞中的摄取动力学行为。HAPL9600的摄取机制主要通过小窝体摄取通路介导并伴随有内吞机制，可避免被溶酶体吞噬后对siRNA产生降解。细胞凋亡实验结果表明，HAPL9600胶束组能显著提高SGC-7901细胞早期凋亡（P < 0.01）和晚期凋亡加死亡（P < 0.05）比例。5、考察透明质酸胶束（HAPL9600）对肿瘤的靶向性。结果表明，HAPL9600胶束能提高siRNA对肿瘤部位的靶向性，荧光标记材料的种类不影响载体的靶向功能。