线粒体铁蛋白保护脑缺血再灌注损伤的铁死亡机制研究

Cerebral ischemia reperfusion (IR) injury is a complicated process affected by many factors.A recent study found that ferroptosis was involved in the pathological process of IR. Mitochondrial ferritin (FtMt) is an iron storage protein located in mitochondria, our previous study has shown that the expression of FtMt in penumbra of IR was notably increased and overexpression of FtMt can inhibit IR induced injury, indicating that FtMt may have protective effects in IR model. Our preliminary experiments have also discovered that the expression of ptgs2, an indicator of ferroptosis, was significantly increased in IR model mice and overexpression of FtMt can inhibite it’s upregulation. Therefore, we hypothesize that the mechanism of FtMt protection on IR induced injury works through ferroptosis pathway.In this project, we will further explore the protective role of FtMt using IR injury models in vivo and in vitro. Then we will detect the changes of regulatory pathways of ferroptosis, such as GPX4 level and ACSL4 level to confirm the mechanism. Finally we will illustrate that FtMt can inhibit ROS accumulation by regulating iron homeostasis and mitochondrial function, which may affect the activation of ferroptosis and protect neuronal cells. The results of our study will not only contribute to the understanding of the mechanisms of ischemic stroke but also provide new insights for the prevention and treatment of this disease.

脑缺血再灌注(IR)损伤是一个受多种因素影响的复杂过程，最近研究表明铁死亡可能参与了其病理过程。线粒体铁蛋白(FtMt)是一种线粒体内的铁储存蛋白，我们的前期结果显示，FtMt在缺血的半暗带表达升高，过表达FtMt可显著缓解IR损伤；我们还发现，IR模型中铁死亡标志分子ptgs2的表达显著上升，而过表达FtMt可抑制其升高，我们猜测铁死亡通路可能是FtMt在IR损伤中发挥保护作用的重要通路。本项目首先利用体内和体外IR模型，进一步确定FtMt在IR模型中的保护作用，之后检测铁死亡调控通路标志性分子GPX4、ACSL4等表达变化，揭示FtMt发挥保护作用的铁死亡机制，最后阐明FtMt通过参与铁稳态及线粒体功能的维持，抑制了ROS的产生，最终影响了铁死亡的发生，发挥了保护作用。本项目的开展不仅能揭示线粒体铁蛋白保护脑缺血再灌注神经损伤的新理论，对与开发治疗脑梗死新药物也具有重要现实意义。

脑缺血再灌注(IR)损伤是一个受多种因素影响的复杂过程，最近许多研究表明由铁依赖的脂质自由基过度积累导致的铁死亡可能参与了其病理过程。我们首先检测了IR损伤组织的铁死亡相关指标的变化情况，铁死亡标记分子ptgs2、ACSL4水平显著升高，脂质自由基(L-ROS)含量也显著升高，而抑制铁死亡的GSH以及GPX4水平则显著下降，确定了铁死亡是I/R中引起细胞死亡的重要形式之一。同时我们发现该组织中线粒体铁蛋白(Mitochondrial ferritin,FtMt)高表达，FtMt缺失使半影区铁沉积加剧，FtMt过表达减缓了半影区铁沉积加剧现象。之后我们选用野生型、Ftmt敲除、Ftmt过表达小鼠进行FtMt保护I/R损伤的铁死亡机制研究。我们发现FtMt敲除促进hepcindin介导的FPN1降解，从而使细胞中铁沉积加剧最终导致脑损伤加重，过表达FtMt则可缓解该损伤。我们对铁死亡相关指标进行了检测，结果显示Ftmt缺失后，ptgs2、ACSL4以及L-ROS水平显著高于对照组，而抑制L-ROS产生的GSH、GPX4水平则显著下降。表明在I/R损伤中，缺少了FtMt的保护作用，铁死亡通路被进一步激活。随后我们又对SH-SY5Y、vector-SH-SY5Y、FtMt-SH-SY5Y三种细胞进行了OGD/R处理，发现过表达FtMt显著缓解了OGD/R引起的L-ROS积累以及GPX4抑制，最终FtMt通过调节铁的分布，维持线粒体的功能，抑制ROS聚积和铁死亡激活。炎症反应是继发性损伤的罪魁祸首再灌注后，炎症也可诱发铁调素表达。因此，我们接下来检查了小胶质细胞的激活，结果显示Ftmt敲除小鼠半影中的小胶质细胞表现出活化的特征形态，并显示扩大的细胞体。实时RT-PCR分析显示FtMt缺乏增加了I/R诱导的促炎mRNA表达细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）。同时，蛋白质印迹分析表明TNF-α、IL-6和磷酸化STAT3(p-STAT3)相对也增加了。这些结果表明I/R损伤后FtMt缺乏促进I/R诱导的炎症反应和铁调素表达，上调的铁调素导致FPN1降解并导致铁在神经元细胞中积累，最终引起铁死亡的产生。本项目揭示FtMt保护脑缺血再灌注神经损伤的新理论，为开发治疗脑中风新药物也具有重要现实意义。