壳聚糖季铵盐连接低分子量聚乙烯亚胺作为骨架的靶向DNA纳米复合物的构建及其抗肿瘤作用研究

拟选择p53为模型基因，首先经化学改性得到壳聚糖季铵盐，并以其连接低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)，得到高分子量PEI衍生物，考察其理化性质，选出转染效率高且细胞毒性小的阳离子聚合物，然后利用整合素αvβ3在人多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该整合素的RGD短肽，与细胞穿膜肽TAT连接，合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的双功能RGDC-TAT，利用交联技术将RGDC-TAT与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统，并考察该系统细胞穿膜及胞内转运、释放机制。同时，与p53自装配成纳米复合物，以重组人p53腺病毒注射液为对照，评价p53/聚阳离子纳米复合物的肿瘤治疗效果。本课题旨在降低PEI细胞毒性，增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，进而提高基因细胞内摄取水平和转染效率，提高肿瘤的基因治疗效果，为基因治疗探索一条有效途径。

本课题针对聚乙烯亚胺（PEI）作为转基因载体使用中存在的问题，通过两亲性壳聚糖OTMCS连接低分子量PEI制备高分子量PEI衍生物，并利用交联技术将双功能R13与该衍生物偶联，研制新型具有主动靶向αvβ3且具有高转染效率、低毒性的DNA纳米复合物，并探讨其细胞穿膜及胞内转运、释放机制。.本课题首先采用固相法合成双功能肽R13，纯度达95%，并表现出良好的肿瘤细胞亲和能力。采用三光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS并交联PEI 2KDa，进而采用SMCC法将R13与OTMCS-PEI偶联形成终产物OTMCS-PEI-R13。红外、核磁等谱图表明目的产物修饰度高且纯度好。该聚合物在37℃下可缓慢水解，约60h水解为小分子聚合物。与DNA形成的复合物呈类球形，粒径150-250 nm，电位适中。OTMCS-PEI-R13-l、OTMCS-PEI-R13-h与DNA质量比分别为1、3时将其完全包裹。同时可保护DNA抵抗300μg/mL肝素钠、23.5 U DNase I/μg DNA 的DNase I及50%血清解离，表明该聚合物有很强DNA保护能力。与PEI 25 KDa相比，该聚合物细胞毒性显著降低，与PEI 2KDa类似。随着w/w升高，OTMCS-PEI-R13转染效率逐渐升高，并显著高于PEI 25 KDa，连接R13后，转染效率更大幅提高。体内试验表明，复合物的体内转染同样优于PEI 25 KDa，偶联R13后，模型基因在肿瘤组织表达增强，表明R13可明显改善复合物的体内分布，具有较强体内肿瘤靶向能力。本课题最后研究了纳米复合物细胞转运机制。OTMCS-PEI-R13修饰R13后，使其细胞摄取表现出了不同特性，可通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞及巨胞饮三条途径内吞入胞，并可能有不依赖能量的非内吞途径存在。复合物入胞后首先经内涵体-溶酶体系统酸化过程而从中逃逸，并以微管为轨道和方向，以动力蛋白为动力来源，在微丝作用下，并有中间纤维协助，向微管“-”端，即细胞核方向转运。RNA与该聚合物有更强亲和性，复合物在细胞核内被RNA解离，从而释放DNA。.本课题已发表SCI论文3篇、CSCD核心库论文1篇，申请发明专利3项，其中授权1项，培养研究生2名，培育课题1项。本课题的实施为解决目前基因给药方式存在的问题和实际应用打下基础，有着一定的理论意义和实践应用价值。