苎麻雄性不育相关候选基因atp9的功能验证

雄性不育是植物杂种优势利用中简化制种程序、降低成本、提高效率的关键所在，在分子水平上揭示雄性不育现象的遗传机理是植物遗传育种科学的热点之一。本项目在完成国家自然科学基金项目"苎麻雄性不育相关基因的克隆和表达分析"基础上，拟用已克隆的苎麻雄性不育相关候选基因atp9，构建由CaMV35S启动子和花特异启动子chsA驱动的植物超表达载体，以及RNAi载体，建立受体苎麻品种的再生技术和遗传转化技术，利用农杆菌介导转化苎麻不育系及其保持系，对转基因后代进行分子、形态和雄性不育性鉴定，验证不育相关基因atp9的生物学功能，分析不同启动子对atp9基因表达的影响，同时可望获得新的雄性不育材料，将为揭示苎麻雄性不育的分子遗传机理、深化苎麻雄性不育杂种优势利用的理论和应用研究积累有益的资料。本项目的研究内容国内外苎麻研究中未见报道。

1 苎麻不育系花序形态：雄性不育系GS14-1败育主要形态特征为花序不能形成分支轴，花序不伸展，雄蕾不膨大、花序外观始终表现为幼龄形态；开花晚期GS14-1雄花已经形成花药结构，但花药内部是否形成小孢子母细胞及败育时期仍有待研究。.2 “一步法”建立苎麻遗传转化再生体系：通过TDZ和IAA、TDZ和NAA、TDZ和2,4-D不同浓度的组合试验，显示激素组合对促进愈伤组织形成和不定芽再生的作用差异很大。在附加0.3 mg/L TDZ和0.05 mg/L 2,4-D的MS培养基上下胚轴愈伤组织诱导率、再生频率和再生芽数均最高。经暗培养预处理的外植体有利愈伤组织形成，而抑制不定芽再生；经光照培养预处理的茎段和幼叶则容易再生不定芽。外植体类型对愈伤组织诱导和不定芽再生的影响较明显，以光培养28d的茎段的再生频率（38.30%）和再生芽数（平均3.07个）最高。.3 苎麻对抗生素的基础抗性：实验结果提示，可选择50mg/L Kan作为不定芽诱导的选择压，40mg/L Kan作为不定根诱导的选择压，5mg/L Hyg和/或400mg/L Cef为不定芽诱导的选择压。.4 载体构建：构建了苎麻雄性不育相关候选基因atp9的35S启动子与花特异启动子超表达载体、atp9的35S启动子与花特异启动子反义表达载体、atp9和atp6的RNAi表达载体、atp9和atp6基因片段+烟草atp2基因前导肽序列表达载体、以及atp9和atpA基因+拟南芥交替氧化酶基因前导肽序列（AOX）表达载体。.5 遗传转化：苎麻atp6和atp9基因RNAi载体转化苎麻获得抗性苗（芽）20多个；用花序浸泡法将苎麻atp6基因RNAi载体转化拟南芥，获得抗性植株，但形态特征没有明显改变；atp9和atpA基因+ AOX载体采用花序浸泡法转化拟南芥，获得AOX-atp9的抗性苗9个，AOX-atpA的抗性苗5个，经PCR、Southern和Northern检测，证明2个外源基因分别整合进入拟南芥基因组并有良好的表达。但这些转基因植株的花粉育性还在进一步观测之中。.6 成果：发表SCI论文2篇、国际英文期刊论文1篇、中文核心期刊论文2篇；接受发表SCI论文1篇、国际英文期刊论文1篇、中文核心期刊论文2篇；培养毕业硕士研究生1名，在读博士研究生2名、硕士研究生2名。