Harpins can function as effector proteins to induce a systemic acquired resistance(SAR) on some nonhost plants. Several studies suggest that the Harpins secretion via type III secretion system.In our previous studies,we first described a novel harpin-like protein, HpaXm, from cotton leaf blight bacteria, Xanthomonas citri subsp. malvacearum,revealed a signal peptide-like sequence in its N-terminus. This suggests that there is probably a type II secretion process involved in the transport pathway of HpaXm. In this study, We intend to use the method of genetic and reverse genetic to demonstrate whether or not the signal peptide will affect the type three secretion process of HpaXm and the HpaXm can be secreted through other pathway except type III seretion system. And then,we are going to confirm the signal peptide of HpaXm using the known II secretory protein,and analyze the T3SS-independent translocation pathway of HpaXm in vivo and vitro by constructing mutant strains of Xanthomonas,deleting the key gene of the type two secretion device and the type three secretion device respectively and observing the secretion process of HpaXm in wild strain and various mutant strains. At last,we want to research the influence of signal peptide of HpaXm on its transportation and function by using transgenic plants. These results will help us further to understand the interaction of pathogen and plant, and the mechanism of plant defense response.
Harpin是一类能诱导抗病性的蛋白类激发子。目前公认Harpin由III 型分泌系统(T3SS)转运。但在前期研究中,我们从棉花角斑病菌首次鉴定了新Harpin类蛋白-HpaXm,二级结构预测显示HpaXm N端存在信号肽序列,暗示HpaXm也可能通过II型分泌系统(T2SS)转运。因此,我们以HpaXm为例,采用遗传学与反向遗传学的方法,研究信号肽是否影响HpaXm的III型泌出方式,利用已知II型分泌蛋白确定HpaXm的信号肽序列,构建黄单胞菌突变菌株,分别敲除T3SS和T2SS泌出通道的关键基因,在离体和活体条件下研究HpaXm不同突变体与其野生型菌株泌出方式,分析黄单胞菌中不依赖T3SS的HpaXm的转运途径;并利用植物转基因途径解析信号肽序列对HpaXm在植物体内转运功能的影响,为研究植物与病原菌互作及植物防卫反应机制提供科学依据。
Harpin是一类能诱导抗病性的蛋白类激发子,目前公认Harpin由III 型分泌系统(T3SS)转运。但在前期研究中,我们从棉花角斑病菌首次鉴定了新Harpin类蛋白HpaXm,二级结构预测显示HpaXm N端存在信号肽序列(LP)。为探究LP对HpaXm转运影响,利用同源置换的原理构建hpaXm缺失突变体,LP缺失突变体及其回补转化株,对其生物特性进行探究表明hpaXm的缺失或是LP的缺失不会影响胞外多糖和胞外酶的活性,但会影响菌体的生长能力;hpaXm的缺失与LP的缺失使Xm激发烟草HR的能力减弱,表明HpaXm蛋白对于HR至关重要,但LP对HR影响不大;构建获得Xm△T3SS与Xm△T2SS(T2SS,II型分泌系统),与Xm相比Xm△T2SS胞外蛋白酶、纤维素酶、胞外多糖的产量无明显变化,但是淀粉酶与胞外脂酶产量均显著减少。Xm△T3SS胞外蛋白酶、纤维素酶、胞外多糖、淀粉酶的产量均无明显变化,但是胞外脂酶产量显著减少。表明xpsL基因与Xm的淀粉酶与胞外脂酶的产量/活性相关。hrcV基因与Xm的胞外脂酶的产量/活性相关。对寄主致病性与非寄主过敏反应检测结果显示,关闭T3SS导致其对寄主失去了致病能力和激发非寄主防卫反应的能力,但是关闭T2SS并没有影响Xm的该能力。综上所述T3SS的关闭影响了HpaXm的泌出,从而导致Xm△T3SS丧失了对棉花的致病性与激发烟草的过敏性反应,HpaXm是通过T3SS分泌的;构建hpaXm与hpaXm△LP转基因烟草植株,通过免疫胶体金技术对HarpinX定位,结果一方面印证了harpin蛋白转到植物中会在质膜上形成运输孔道,诱导植物对不同的病原体产生抗性;另一方面说明了LP的表达一定程度上影响了它在植物中的作用位点,缺失LP可以正常表达但无法被定位在植物细胞壁上,只能是定位在质膜内发挥作用,但HpaXm可以定位于植物细胞壁上, LP决定HpaXm在细胞壁的定位。LP对黄单胞菌致病力的影响不大,但内源表达均增强了烟草对TMV的抗病性,项目组研究同时在国际上首次成功驯化了Xm菌株,大大提高了转化效率,这些结果对harpin在植物细胞与病原菌互作机制中的作用有了更加深入的了解,为植物与病原互作机制中填补了新的内容。
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数据更新时间:2023-05-31
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