程序性坏死通路在PRV变异株感染与诱导坏死性炎症中的作用及分子机制研究

At present, the variant strain of Pseudorabies virus (PRV) has become the main epidemic strain in piglets in China. Compared with the classical strain, pigs infected by PRV variant strains are characterized by the pathology of the necrotizing inflammatory, while the mechanism of it is not clarified. In the previous study, we found that PRV variant strains induced necrotic cell death and the phosphorylation of MLKL. Necroptosis is a recently reported cell death manner which is regulated by the cascade reaction of RIPK1, RIPK3 and MLKL. We believe that it is likely to be involved in the necrotic progress of cells and the necrotizing inflammatory response during PRV variant strains infection. Hence, further research will be performed in this project. PRV variant strains will be utilized to infect porcine kidney cells PK-15. By using electron microscopy and confocal immunofluorescence microscopy, cell micromorphology and the interaction of functional molecules will be analyzed to explore the mechanism of necroptosis in cells infected by PRV variant strains. Taking advantage of drug interference and gene silence, we will perform the reverse research to confirm the role of necroptosis in intracellular replication and extracellular release during PRV variant strains infection. Further, the role of necroptosis in the necrotizing inflammatory was analyzed by a comprehensive study of tissues and organs in pigs infected by PRV variant strains.

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）变异株已成为我国猪群中的主要流行毒株。与经典株相比，PRV变异株感染猪的病理变化以多器官坏死性炎症为主要特征，但其具体机制仍不清楚。课题组前期发现，PRV变异株感染可引起细胞坏死和MLKL分子磷酸化。程序性坏死是最新发现的一种受RIPK1/RIPK3/MLKL级联调控的细胞死亡方式，我们相信它很可能与PRV变异株诱导的坏死性炎症有关。鉴于此，我们拟以PRV变异株感染猪肾上皮细胞PK-15，利用透射电镜、激光共聚焦等技术对细胞微观形态、功能分子互作进行研究，揭示PRV变异株感染对程序性坏死的调控作用及分子机制；通过药物干预与基因沉默等手段抑制通路关键分子进行反向研究，明确程序性坏死在病毒胞内复制与胞外释放等感染过程中的作用。进一步的，通过对PRV变异株感染猪局部组织器官的综合检测，分析程序性坏死在PRV变异株诱导坏死性炎症中的作用。

伪狂犬病毒感染（PRV, pseudorabies virus）感染猪的病理变化以多器官坏死性炎症为主要特征，但其具体机制仍不清楚。围绕PRV诱导坏死性炎症的机制开展相关研究，对于揭示其致病机制具有重要的科学意义，可为目前临床上猪伪狂犬病的防控寻找新途径、提供新策略。程序性坏死是最新发现的一种受RIPK1/RIPK3/MLKL级联调控的细胞死亡方式，发生后导致的细胞内容物大量外泄，是导致炎症反应发生的主要原因。本项目证明了PRV诱导的细胞死亡形式为坏死，虽然可促进TNF-a的表达，但却抑制Caspase和RIPK1的活化，因此其诱导的细胞坏死与凋亡通路和RIPK1无关。同时，我们发现PRV感染细胞后可促进RIPK3、MLKL分子的磷酸化，通过ZBP1促进RIPK3和MLKL的相互作用，从而激活程序性坏死通路，导致细胞的膜穿孔、内容物泄露和死亡，并发现RIPK3或MLKL基因沉默可促进PRV的复制。另外，我们证明了PRV感染诱导细胞活性氧产生是维持ZBP1/RIPK3/MLKL信号级联反应的关键因子，通过BHA或4-OI可有效抑制PRV感染引起的细胞坏死，发现了有效的药物靶标。体内感染试验证明，PRV感染可引起猪肺脏、脑、脾脏等多器官出现明显的出血、坏死，HE染色可发现PRV感染猪的肺脏、脑组织有明显的炎性细胞浸润，免疫组化分析发现PRV感染猪的组织呈现MLKL阳性，表明PRV感染诱导的坏死性炎症与程序性坏死通路密切相关。根据上述发现，我们进一步利用CRISPR-Cas9技术构建了RIPK3和MLKL基因缺失的PK-15细胞株，证明了RIPK3和MLKL基因缺失细胞株可明显提高PRV野毒株和疫苗株Bartha-K61上的滴度，为PRV疫苗生产提供了有效材料。相关研究内容发表SCI论文2篇和核心期刊论文1篇，申请国家发明专利2项，其中1项已获得授权。