高亲和磷酸盐转运蛋白在蜈蚣草砷污染植物修复中的功能研究

Pteris vittata, the first arsenic hyperaccumulator identified, has very strong ability to absorb the arsenic, so it is widely used in phytoremediation of arsenic contaminated soil. However, the molecular mechanism of arsenic uptake efficiency of Pteris vittata is not clear. As a phosphorous analogs, arsenate is absorbed mainly by the phosphate transporter Pht1. Using the transcriptome sequencing and gene cloning, three members of Pteris vittata Pht1, Pht1;3, Pht1;4 and Pht1;5, have been identified. In this proposal, we will verify their arsenic transport capacity through the analysis of arsenic content in different Pht1 strains of yeast transformation lines; analyze absorption, translocation and accumulation of arsenic in Pht1 expression Arabidopsis lines; identify tissue specific expression pattern and subcellular localization, using insitu hybridization and GFP fusion protein, respectively. Combing the expression pattern, subcellular localization characteristics and functional analysis in yeast and Arabidopsis, the function of the Pteris vittata Pht1 in arsenate absorption will be identified, which will contribute to improving the efficiency of phytoremediation of arsenic contaminated soils and provide important genetic resources.

蜈蚣草是世界上被发现的第一种砷超富集植物，对砷具有极强的吸收萃取能力，因此被广泛应用于砷污染土壤的植物修复。然而，截至目前，蜈蚣草高效吸砷的分子机制并不清楚。作为磷的类似物，砷主要通过磷酸盐转运蛋白Pht1被植物吸收。本项目前期通过转录组测序和基因挖掘，克隆得到了3个蜈蚣草砷吸收相关的Pht1基因：Pht1;3，Pht1;4和Pht1;5。基于此，本项目将以不同Pht1为研究对象，通过分析不同Pht1酵母转化株砷含量，验证其对砷的转运能力；将不同Pht1基因导入模式植物拟南芥中，分析其对拟南芥砷吸收、转运和积累的影响，解析其在植物砷吸收中的功能；采用原位杂交、GFP融合蛋白等技术手段，明确不同Pht1在蜈蚣草中的组织定位和亚细胞定位特征，并结合其在酵母和拟南芥中的功能，分析其在蜈蚣草高效砷吸收中的作用，为提高砷污染土壤植物修复效率提供重要基因资源。

重金属污染土壤的治理与修复是重大的国家战略需求。砷（Arsenic, As）在自然界中广泛存在，环境中的砷通过食物链进入人体会引起强烈的致癌作用。砷超富集植物蜈蚣草已经被广泛用于砷污染土壤的植物修复实践，但是其砷超富集分子机制依然不清楚。.本项目聚焦于蜈蚣草吸收砷酸盐（AsV）的分子机制展开研究。通过构建高质量的蜈蚣草转录组，我们分析基因序列并克隆获得了蜈蚣草中的多个AsV吸收转运、还原过程的关键基因。利用酵母磷转运突变体体系，我们发现PvPht1;3、PvPht1;4具有显著强于PvPht1;2及普通植物磷转运蛋白的AsV转运能力。同时，在AsV暴露条件下，PvPht1;3的表达维持不变，而PvPht1;4的表达丰度受AsV诱导上调。通过染色体步移获得PvPht1;3启动子并连接报告基因，我们在转基因大豆和拟南芥根系双系统中发现，PvPht1;3在根系中柱有较强表达，暗示了PvPht1;3在AsV由根系向地上部转运过程发挥重要作用。在烟草中表达PvPht1;3，能够显著增强转基因烟草株系对砷的吸收和向地上的转运，结果说明PvPht1;3具有很强的AsV转能力，并且在蜈蚣草根系AsV向地上部转运过程中发挥关键作用。.在模式植物中，砷酸还原酶HAC1在根系对AsV的还原作用是砷解毒的关键步骤。我们发现，蜈蚣草中有两个HAC1同源基因：PvHAC1和PvHAC2，二者均定位于细胞质和细胞核中。利用大肠杆菌砷敏感突变体和转基因拟南芥，研究发现二者均具有典型的砷酸还原功能。PvHAC1主要在根状茎中表达，并受AsV胁迫的强烈诱导；PvHAC2主要在羽叶中表达。而模式植物中HAC1在根系特异表达，表达模式的显著区别说明，蜈蚣草在根系缺失HAC基因的还原作用，可能是蜈蚣草超富集砷的关键环节之一。.（二家族磷转运蛋白）PHT2主要定位在叶绿体上，负责叶绿体磷的获取，其对AsV的转运能力并不清楚。本研究中，我们发现蜈蚣草中的PvPht2;1是一个低亲和力的磷转运蛋白，对砷的转运能力较弱。在拟南芥中表达PvPht2;1，显著增加叶绿体中的磷积累，并在砷胁迫条件下改善植物的光合效率。PvPht2;1可能在磷从细胞质向叶绿体的转运中发挥作用，从而增加了植物对砷的耐受性，减少了砷对光合作用的损伤。