Ptc-miR397a及漆酶在毛果杨木质素单体聚合中的作用

已发表的数据表明，毛果杨Ptc-miRNA397a可能通过调控漆酶基因的表达来参与木质素单体的聚合。为寻找漆酶参与木质素单体聚合的遗传学证据，揭示木质素单体聚合的分子机制、探索调控木质素生物合成的新方法，本项目拟从miRNA对靶基因的调控作用入手，以模式木本植物毛果杨无性系Nisqually-1为试材，利用RACE法克隆全长或近似全长的Ptc-miR397a基因，构建组成型过表达载体及木质部特异表达载体，农杆菌法转化杨树幼嫩茎段；通过转基因植株木质素含量、组分及结构分析以及差异基因数字表达谱分析，筛选差异表达的漆酶基因及其他基因；采用改进的5'RACE法进一步验证导致这些基因差异表达的原因是否因Ptc-miRNA397a直接降解所致，从而找出直接受Ptc-miRNA397a调控并参与木质素单体聚合的漆酶基因，为利用生物技术调控木质素生物合成、培育适合人类需要的新品系提供新的思路和方法。

以前研究表明漆酶在木质素单体聚合中起着重要作用。我们发现毛果杨漆酶是ptr-miR397a的靶基因。为了揭示ptr-miR397a及漆酶在毛果杨木质素单体聚合中的作用，本研究以毛果杨无性系Nisqually-1为试材，首先在基因组范围内鉴定了毛果杨漆酶基因。psRNATarget靶基因预测结果显示49个漆酶基因家族中29个是ptr-miR397a的靶基因，其中13个靶基因漆酶在木质部中表达，7个PtrLACs得到5′RACE验证。组织特异性表达分析表明，在木质部中表达的漆酶有34个，其中17个高丰度表达的基因序列与拟南芥中影响木质素含量的AtLAC4和AtLAC17同源性较高。克隆得到一个长1387bp的 Ptr-MIR397a基因序列。Ptr-miR397a和ptr-miR397a*位于Ptr-MIR397a序列的5′ 端。将Ptr-MIR397a克隆到pBI121载体上，构建了由CaMV 35S启动子调控的pBI-CaMV35Sp::ptr-MIR397a组成型过表达载体及木质部特异表达载体pBI-Pt4CLp::ptr-MIR397a。利用农杆菌侵染法获得了大量的转基因株系。通过分析6个月转基因株系的茎横切面结构、木质素含量、组分及木质素单体结构，发现Ptr-MIR397a过表达可以降低Klason木质素的含量（12%～22%），但木质素单体的组成和结构几乎没有什么变化。利用高通量测序技术及生物信息方法对转基因系和野生型茎木质部基因差异表达情况进行了系统分析，差异表达的基因有459个，289基因表达下调，170个基因表达上调，其中17个木质部表达的漆酶基因调控32–86%，而木质素单体合成相关基因表达没有变化，可见转基因植株木质素含量下降是因为漆酶表达降低引起的。差异表达基因的结构域分析结果显示，其中漆酶、多铜氧化酶、铜还原蛋白、氧化物酶等具首位。基因调控网络（GRN）显示，13个漆酶和4个氧化物酶受ptr-miR397a和一些转录因子的调控，共同调控木质素的生物合成。本研究为本研究为生物能源杨树的分子育种和高效利用林木生物 质能源提供了理论依据和技术支持。我们还发现，个别转基因株系与野生型表型差异很大，如丛生型株系（顶端优势减弱）、红色株系等。近期有研究表明，漆酶可能与植物体对油菜素内酯敏感性有关。目前我们正在寻找引发这些表型的实验证据，相关研究正在进行中。