利用基因编辑技术构建大鼠PH1模型并开展基因治疗研究

Primary hyperoxaluria type 1（PH1) is an abnormal metabolism of oxalate and fatal urinary stones. It is caused by mutations of AGXT. There is no effective treatment other than combined liver kidney transplantation. In the study of gene therapy of mouse PH1 model, the strategy of overexpression of AGXT imported by AAV in hepatocytes can reduce the concentration of urinary oxalic acid in the short term. However, the integration of AGXT into the genome is not efficient and effective for a long time. CRISPR/Cas can accurately and efficiently achieve genome editing. It is expected to achieve long-term therapeutic effect. The rat model of AGXT gene mutation has been established by PH1 in our group. It is necessary to construct a new animal model of PH1, which is more closely related to humans, through detailed phenotypic analysis. Further study on gene therapy of PH1 will be carried out using AAV liver directed infection and CRISPR/Cas gene editing technology in three ways. These three approaches are in situ repair of AGXT mutation site, integration of AGXT cDNA into the liver cell genome, and the elimination of acid oxidase 1 (the upstream of oxalate and was encoded by HAO1). This study will provide the best treatment plan and an effective gene strategy for PH1.

原发性1型高草酸尿症( Primary hyperoxaluria type 1,PH1)是AGXT基因突变所致的草酸代谢异常，易引起致死性泌尿系结石，除了肝肾联合移植没有有效治疗办法。在小鼠PH1模型中，AAV导入AGXT在肝细胞过表达的策略能在短期内降低尿草酸浓度，但AGXT整合入基因组的效率低，无法长期有效。CRISPR/Cas能精准、高效地实现基因组编辑，有望达到长期治疗的效果。课题组已建立AGXT基因突变的大鼠PH1模型，拟通过细致的表型分析，构建代谢特征更接近人类的新的原发性PH1动物模型。进一步利用课题组已建立的AAV肝脏定向感染和CRISPR/Cas基因编辑技术，分别通过原位修复AGXT的突变位点、将AGXT cDNA定点整合入肝细胞基因组以及敲除草酸代谢上游羟基酸氧化酶1（ HAO1基因编码）这三种途径进行基因治疗研究，优选最佳治疗方案，为根治PH1提供有效的基因策略。

Ⅰ型原发性高草酸尿症（PH1）是AGXT基因突变引起的常染色体隐性遗传病。AGXT基因突变导致肝脏内乙醛酸大量累积并在乳酸脱氢酶的作用下转化成草酸，最终引起泌尿系统结石和终末期肾病。该病目前无特效药，只能通过肝-肾联合移植根治。CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅速发展和应用给遗传疾病的治疗提供了新方向。因此本项目通过基因编辑技术对草酸合成通路进行调控，以此探索PH1长久有效的治疗策略。.首先，本项目构建了部分人源化的AgxtD205N大鼠，该大鼠Agxt基因部分序列被一段含p.D205N 突变的人源化序列替代。模型大鼠AGT蛋白表达缺失，出生后一个月即表现高草酸尿，尿草酸结晶明显，部分形成膀胱结石，在乙二醇短期诱导后形成大量肾脏草酸钙沉积，与PH1患者临床表现高度接近。.接着，用CRISPR/Cas9在体敲除肝脏乙醇酸氧化酶的策略减少乙醇酸向乙醛酸的转化。先在体外筛选得到靶向Hao1基因（编码GO）的高活性sgRNA并与Cas9蛋白一起包装成腺相关病毒（AAV），随后对PH1新生大鼠进行尾静脉注射给药。结果显示，治疗组PH1大鼠30%的肝脏细胞Hao1基因得到敲除，GO蛋白表达下降，尿草酸水平比对照组降低了42%，有效预防了乙二醇诱导下的肾草酸钙沉积并在12个月的研究周期内疗效保持稳定。对基因药物的安全性评估显示，治疗组大鼠肝功能正常，肝组织无病理变化，并且CRISPR/Cas9未产生明显脱靶效应。.最后，研究通过CRISPR/Cas9特异性靶向LDH直接减少草酸合成治疗PH1的可行性。研究结果显示，治疗组PH1大鼠Ldha基因敲除效率近20%，肝脏LDH表达显著降低，尿草酸水平降低近40%。乙二醇诱导条件下，治疗组大鼠草酸升高程度和肾脏草酸钙沉积相比对照组轻微。治疗组大鼠肝功能均保持正常，无明显的肝损伤病理表现，未检测到基因编辑相关的脱靶效应和肝外器官Ldha基因的编辑效应。.综上所述，本项目证明了PH1大鼠模型为创新药物的开发和评价提供了有力的工具，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向草酸合成的上游通路是PH1的一种持久且安全的治疗策略，具有临床转化价值。