青藤碱的生物转化及代谢产物抗炎活性研究

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以关节病变引起肢体严重畸形，关节滑膜炎及心肺、皮肤、血管等结缔组织广泛性炎症为主要表现的慢性全身性自身免疫性疾病，严重可致残。该病是导致我国社会劳动力丧失的主要原因之一，市场上尚无高效低副作用的治疗药物。申请人以目前临床广泛用于治疗该病的天然吗啡烷类生物碱-青藤碱为研究对象，结合其结构特征和化学性质，将微生物学、化学及药理学有机结合起来，运用生物转化方法，对青藤碱进行结构改造，克服青藤碱分子结构缺陷带来的低药效及药理副作用。同时利用人滑膜肉瘤细胞SW982体系，通过对与RA发病紧密相关的细胞因子IL-6的测定，评价青藤碱结构改造产物的抗炎活性，阐明结构-活性关系，筛选1-2个高效抗炎先导化合物。本项目提出的微生物催化芳基化合物交叉偶联反应丰富了有机合成方法；本项目的实施可为研发具有自主知识产权的抗RA新药提供新的契机。

项目采用生物催化方式对中草药青风藤的主要药效成分青藤碱进行结构改造。完成如下研究：①建立了500株转化微生物资源库；建立了青藤碱微生物转化模型，总共筛选出40株真菌对青藤碱具有转化作用，利用rDNA-ITS序列测定法进行种属鉴定。②完成全部转化产物的结构鉴定。青藤碱具有刚性的化学结构，微生物转化产物基本上都是(S)和(R)-disinomenine，转化产物类型单一；真菌 JZT-S1-1-2转化青藤碱所得产物鉴定为Sinomenine N-oxide。③微生物体内氧化酶的抑制。鉴于青藤碱微生物转化产物的单一性，通过合成4-甲氧基青藤碱来抑制微生物体内过氧化物酶，从而获取更多代谢物类型，成效甚微。④微生物体内氧化酶的利用。利用氧化酶来催化不同位置的碳碳偶联反应，完成了三方面的工作：Coriolus unicolor成功的催化青藤碱和1, 2-二羟基苯酚合成碳碳交叉偶联产物1-(1ʹ,2ʹ-二羟基-4ʹ-苯基)-青藤碱，该化合物具有较强的IL-6抑制活性；合成了3,4-二羟基青藤碱和3,4,10β-三羟基青藤碱作为底物，利用Antrodiella semisupina和Coriolus unicolor催化合成2位和1,2位碳碳偶联产物，该部分工作正在进行中，成果未发表；立体选择性催化合成了S双青藤碱及其衍生物。⑤青藤碱四聚体的形成。Coriolus unicolor在无金属离子的条件下，催化青藤碱生成(S)和(R)-disinomenine；当Mg2+存在时，会进一步催化(S)-disinomenine形成青藤碱四聚体Tetrasinomenine。该催化过程中的相关酶正在分离鉴定中，其后续酶学性质也是项目结题后的研究重要方向。该研究成果未发表。⑥能转化青藤碱的微生物次级代谢产物以多酚化合物为主。对青藤碱具有转化能力的真菌Nigrospora sp. BM-2 和Penicillium citrinum BM7的次级代谢产物结构类型以蒽醌和多酚化合物为主；当通过改变培养条件（添加3% NaCl）使得Nigrospora sp. BM-2中多酚化合物代谢途径被抑制后，其体系不再具备转化青藤碱的能力。⑦项目发表研究论文8篇，其中SCI论文2篇，中文核心论文3篇，会议论文3篇；培养毕业研究生1名，本科生7名，获湖北省优秀学士学位论文3篇。参加国内外会议4次，共计8人次。