贵阳腐霉菌CRN类效应子的杀蚊功能与作用机制研究

Pythium guiyangense Su is an oomycete pathogen of mosquitoes isolated from mosquito larvae by a Chinese scientist and has been proved a promising agent for biological control of mosquitoes. Most of oomycetes are plant pathogens which could manipulate host immune responses or even kill host cells by producing a large number of effector proteins with different biochemical functions. P. guiyangense is also a member of oomycetes, however the biochemical activities of effector proteins produced by P. guiyangense to mosquitoes and molecular mechanisms are still not clear. In this project, several CRN effector proteins of P. guiyangense will be chosen to evaluate their infection to mosquitoes using genetic transformation methods. The virulent effector proteins during mosquito infection will be expressed using prokaryotic and eukaryotic expression systems. The obtained proteins will be purified for testing infection rates to mosquitoes。Meanwhile, target proteins of CRN effector proteins in mosquitoes will be investigated using Yeast Two-Hybrid systems, followed by exploring the molecular mechanisms of interactions between CRN effectors and target proteins. Additionally, comparing with CRN effectors from plant-pathogenic Pythium species, the evolutionary mechanism of Pythium species with different hosts will be investigated. This project will uncover the virulent function and molecular mechanisms of P.guiyangense CRN effectors in the evolutionary adaptation to the mosquito host, and will be expected to provide valuable genes for controlling insect pests.

贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）是由我国科学家分离出来的一株具有灭蚊活性的生防菌，隶属于卵菌。已知卵菌多数为植物病原菌，通过产生效应子来干扰寄主免疫反应甚至杀死细胞，但关于昆虫生防卵菌效应子的功能与机制目前还知之甚少。本项目拟选取贵阳腐霉代表性CRN效应子，利用遗传转化方法逐一评估它们对蚊虫的杀虫活性，获得致病关键CRN效应子；表达纯化后，研究它们对蚊虫的体外毒力效应，获得新型杀虫蛋白；利用酵母双杂交方法在蚊虫中筛选其靶标蛋白，进一步研究靶标蛋白在蚊虫免疫反应中的功能，阐明效应子与其互作干扰其正常功能的机制。同时与其它植物寄生腐霉菌的CRN效应子比较，探讨腐霉菌适应不同寄主的分子进化机制；本研究将揭示CRN效应子在贵阳腐霉侵染蚊虫过程中的功能与机制，明确贵阳腐霉的致病机理；阐述腐霉菌侵染不同寄主（昆虫与植物）的适应机制；还有望为害虫控制提供有价值的新基因和新蛋白。

CRN (Crinkling and Necrosis inducing Protein) 效应子是一类广泛存在于植物病原卵菌内的致病因子，因其能够诱导植物细胞的死亡而命名。当病原卵菌侵染植物时分泌CRN效应子到寄主细胞内，通过干扰植物的免疫反应促进病原菌侵染。贵阳腐霉是一种能侵染蚊虫的腐霉菌，在蚊虫防治方面具有广阔的应用前景。前期我们实验室通过对贵阳腐霉全基因组序列的研究分析，鉴定到了29个CRN效应子，但这些CRN效应子在贵阳腐霉侵染蚊虫中发挥的作用尚不明确。本项目通过对29个CRN效应子在草地贪夜蛾Sf9细胞系中进行表达，然后利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒测定细胞活性，筛选出了13个能引起Sf9细胞死亡的贵阳腐霉CRN效应子；进一步利用大肠杆菌原核体系将13个CRN蛋白表达并纯化，纯化后的蛋白分别处理草地贪夜蛾Sf9细胞和白纹伊蚊C6/36细胞系后检测细胞活性，从中筛选出了2个诱导Sf9细胞和C6/36细胞死亡的毒性CRN效应子，即CRN31、CRN40。我们并对CRN31的作用分子机制进一步深入研究，发现CRN31与贵阳腐霉侵染蚊虫的密切相关，在侵染初期CRN基因表达显著上调，并且定位在细胞的细胞质中；通过在白纹伊蚊C6/36中表达CRN31，利用CRN31与互作靶标的免疫共沉淀以及测序，筛选到了CRN31的18个候选靶标互作蛋白。同时我们对贵阳腐霉CRN效应子家族进行了系统的进化特征分析，发现贵阳腐霉的CRN基因的序列变异大，在CRN蛋白的C端鉴定到多个特有的功能域，推测与其适应蚊虫寄主环境相关。因此，本项目第一次阐明了蚊虫病原卵菌贵阳腐霉CRN效应子在侵染蚊虫中诱导寄主细胞死亡的致病分子机制，明确了其特异性分子进化机理，并且此项目所获得的具有杀蚊活性的CRN31和CRN40效应子为将来蚊虫的防治提供了有价值的新基因和新蛋白。