间充质干细胞通过TNT转运线粒体保护类缺血损伤的脑微血管内皮细胞的研究

前期实验中，我们建立了间充质干细胞与类缺血损伤的脑微血管内皮细胞的共培养模型，发现两种细胞间的直接接触能有效保护受损内皮细胞的线粒体功能，减少细胞凋亡，但该现象的机制尚不明确。随后我们又通过电镜发现两种细胞间建立了一种膜管状结构，对其形态结构与生理特征的研究证实该结构即为新近发现的隧道纳米管（TNT）。作为一种全新的细胞间通讯连接方式，TNT被证实可在细胞间直接转运线粒体。由此我们推测：干细胞通过TNT将自身线粒体直接转运至受损内皮细胞中，修复其能量代谢并减少细胞凋亡，以发挥对内皮细胞的保护作用。为验证这一假设，我们拟采用RCFP特异性标记干细胞线粒体，观察其在TNT内的转运情况；分析各实验组中内皮细胞凋亡率、线粒体蛋白表达水平和线粒体活性指标；再利用SNP分型进一步证实转移至内皮细胞的线粒体来源于干细胞；以揭示干细胞修复受损内皮细胞的机制，为其在缺血性脑血管病治疗中的应用提供理论依据。

背景：我们在前期实验中发现干细胞与类缺血损伤的内皮细胞的直接接触能有效保护受损内皮细胞的线粒体功能，减少细胞凋亡。我们推测该保护作用与一种全新的细胞间通讯连接方式隧道纳米管(tunneling nanotubes，TNT)相关。. 方向：1、探讨间充质干细胞与共培养的内皮细胞间能否建立TNT结构联系。2、探究影响TNT形成的因素并揭示其形成机制。 3、探讨线粒体能否通过TNT在两种细胞间进行有效的转运。4、探讨干细胞能否通过TNT转运线粒体保护类缺血损伤的内皮细胞。. 主要内容：1、对比分析间充质干细胞与脐静脉内皮细胞的线粒体功能。2、建立干细胞与类缺血损伤后内皮细胞的共培养模型。3、激光共聚焦显微镜观察隧道纳米管的形成及线粒体在其中的转运。4、应用流式细胞术分选并定量分析混合培养后两种细胞间线粒体的相互转移率。5、分析干细胞对共培养内皮细胞的有氧代谢、细胞活性及凋亡率的影响；并检测丝状肌动蛋白解聚剂latrunculin-A（LatA）、磷脂酰丝氨酸位点阻断剂Annexin V和线粒体DNA缺失的干细胞对其保护效应的影响。6、分析干细胞的旁分泌功能和细胞融合等因素对内皮细胞活性的影响。. 重要结果及关键数据：1、间充质干细胞具有显著优于脐静脉内皮细胞的线粒体功能。2、共培养的干细胞与内皮细胞间可建立隧道纳米管结构联系，线粒体可在其中进行双向转运。3、类缺血再灌注损伤能介导内皮细胞与干细胞间建立更为复杂和广泛的TNT网络，并加速线粒体由干细胞向内皮细胞方向转移。4、LatA和Annexin V可显著减少内皮细胞与干细胞间的TNT数量，TNT的形成是依赖丝状肌动蛋白的聚合和磷脂酰丝氨酸的外化的过程。5、干细胞通过隧道纳米管将自身线粒体转运至类缺血再灌注损伤的内皮细胞内，以修复其有氧代谢功能并减少细胞凋亡。LatA和Annexin V可显著抑制该保护效应。6、干细胞的旁分泌功能和细胞融合等因素不是其保护内皮细胞的关键机制。. 科学意义：1、本研究发现并证实干细胞可通过TNT转移线粒体以保护缺血损伤的内皮细胞，揭示干细胞修复受损内皮细胞的新机制，为干细胞移植治疗缺血性血管疾病提供了新的理论依据。2、本研究揭示了TNT的形成机制，提出TNT的形成可能是细胞在应激或损伤状态下表现出的一种自我防御和营救效应，为进一步认识这一新型的细胞间通讯方式奠定了基础。