糙皮侧耳和酿酒酵母的融合株生长与木质素降解偶联机制的研究

There are more and more researchers and breeding to attend to utilize microbiology to degrade lignin for supplying hosts with digestible vegetable feed. According to the characteristics of strong degradation of lignin ability, slow engraftment in natural state, more strict fermentation conditions in Pleurotus ostreatus, and fast growth of Saccharomyces cerevisiae, strong ability in volatile fatty acids and bacteria high in protein. This study will use protoplast fusion to meld Pleurotus ostreatus and Saccharomyces cerevisiae together for establishing fusant with rapid degradation ability of lignin. This research will carry out the following works: （1） the key factor affects the growth of fusant and degradation of lignin; （2）the other critical question is the coupling relationship between the growth of fusant and degradation of lignin. This study will try to study gene， lignin degradation gene transcription and protein expression of fusant in degradation process according to study the growth phase coupling of lignin rapid degradation mechanism by building the metabolic network model. This research will analyze the rapid degradation mechanism of fusant in-depth at the molecular level. It will provide theoretical foundation for constructing efficient microorganism of lignin. And it will lay the foundation to improve the feed utilization value, develop new type of feed resources and relieve food contradiction between human and livestock.

利用微生物降解木质素进而提供动物可消化的植物性饲料，受到研究者和养殖业广泛关注。针对白腐真菌降解木质素能力强、生长缓慢、发酵条件严格和酿酒酵母生长速度快，产挥发性脂肪酸，菌体蛋白含量高等特点，申请者采用原生质体融合技术构建出白腐真菌（Pleurotus ostreatus）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）具有木质素快速降解能力的融合子。本课题围绕：（1）融合子生长和木质素降解影响关键因素；（2）融合子的生长和木质素降解基因二者间的偶联关系两个关键科学问题；尝试从基因、转录和蛋白等系统生物学水平上研究融合子在木质素降解过程中基因的转录和蛋白的表达变化，通过构建代谢网络模型研究与生长相偶联的木质素快速降解机理。预期结果将从分子水平上深入分析融合子木质素快速降解的机理，为构建高效的木质素降解微生物提供理论基础，为提高饲料利用价值，缓解人畜争粮矛盾奠定基础。

木质素的存在限制了纤维素酶对纤维素及半纤维素的可利用性，导致其水解效率和可利用率降低。若进行预处理去除或修饰木质素则可以促进木质纤维素的分解。木质素降解真菌可以相对高效地降解木质素，其反应条件温和、无污染，在生物前处理领域受到了越来越多人的关注。.目前，人们普遍认为木质素降解菌之一的白腐真菌利用木质素降解酶系将木质素矿化，而另外一种褐腐真菌则利用Fenton反应切割木质素。近来的报道多集中于重要木质素降解酶类的功能和结构探究，但现有的木质素降解酶还无法在体外反应体系中降解木质素。另外，木质素降解酶类的反应机制的探究仅基于木质素模型化合物而非天然木质素。同时，丝状真菌的多基因敲除技术还不成熟，这意味着这些酶类的功能还无法利用遗传学的手段进行验证。因此，现有的木质素降解机制仍亟待完善，同时也可能存在新的降解机制。借助于糙皮侧耳和酿酒酵母远缘原生质体融合技术，经过不同碳源的固体培养、酶活测定及分子水平的验证，获得了一株不含有目前同属已知的木质素降解酶、但能够利用玉米秸秆生长的融合子D1-P。经过融合子处理后的玉米秸秆木质素损失量和对照组存在极显著差异，说明，该融合子可以在没有传统木质素降解酶存在的情况下降解木质素，有可能存在新的降解机制。为进一步验证该假设，利用核磁共振技术对经过融合子D1-P降解的玉米秸秆木质素的结构进行表征。核磁共振谱分析不但验证了D1-P可以降解木质素的结论，还出现了不同于野生型的降解产物。以往的报道中也并没有匹配这一降解产物的化学位移的信号，这一结果表明了融合子D1-P可能存在新的木质素降解机制。对不同化学键进行半定量积分分析后，推测新降解产物类似于二苯并二恶英，说明融合子可能利用不同的机制降解了木质素。为进一步确认融合子中不存在经典的木质素降解酶基因，我们还通过基因组扫描对此结论进行了验证。这一结果会丰富真菌木质素降解机制的内容，为全面理解真菌对于木质素的降解提供更多的信息。