蟾毒灵抑制ACOX2介导的脂肪酸氧化调控肝细胞癌微环境中T细胞浸润的机制研究

Our previous study revealed that bufalin was a potential regulator of immune microenvironment of hepatocellular carcinoma（HCC）. However, the exact impact of bufalin on immune microenvironment of HCC and underlying mechanisms are unclear. Increasing evidences demonstrated that the energy metabolism of tumor cells was closely related to the tumor immune microenvironment. Our study found that bufalin inhibited fatty acid oxidation of HCC cells by downregulating ACOX2. We also found that the expression of ACOX2 in HCC tissues was negatively correlated with the levels of CD8+T and CD4+T cells infiltration. Hence, we hypothesized that bufalin regulated the HCC immune microenvironment via inhibiting ACOX2-mediated fatty acid oxidation, resulting in increased infiltration of effector T cells. The present study will evaluate the impact of bufalin in regulating T cells infiltration in HCC microenvironment and underlying mechanisms by the following two models: co-culture model of human HCC cells and HCC patient-derived PBMC, immune system humanized xenograft model in mice. These results will clarify the regulatory factors of the HCC immune microenvironment, and provide a theoretical basis for the use of bufalin as an immuno-microenvironment regulator for HCC treatment. We use Huachansu as a control to facilitate the transformation of our finding.

课题组前期研究提示，蟾毒灵是潜在的肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）免疫微环境调节剂，但具体作用及机制有待进一步研究。越来越多的证据表明肿瘤细胞的能量代谢与肿瘤免疫微环境密切相关。我们研究发现，蟾毒灵通过下调ACOX2抑制肝癌细胞的脂肪酸氧化。进一步的生物信息分析发现，HCC组织中ACOX2的表达与CD8+T细胞、CD4+T细胞的浸润程度呈负相关。因此，我们提出假说：蟾毒灵下调ACOX2抑制肝癌细胞的脂肪酸氧化，进而调控HCC免疫微环境，增加抗肿瘤效应T细胞的浸润。本课题将通过人肝癌细胞与HCC患者外周血来源PBMC共培养模型、免疫系统人源化小鼠肝癌移植瘤模型研究蟾毒灵调控HCC微环境中T细胞浸润的作用及机制。研究结果将阐明HCC免疫微环境的调控因素，为蟾毒灵做为免疫微环境调节剂用于HCC治疗提供理论依据。本研究增设华蟾素对照组，有利于研究成果的转化。

蟾毒灵有显著的抗肝癌作用，具体作用机制既往有诸多报道，但蟾毒灵调控肝癌细胞的脂肪酸代谢、免疫微环境尚未见报道，具体作用及机制有待进一步研究。本研究发现蟾毒灵通过干预ATP1A1/CA2 轴抑制肝细胞癌脂质生成和脂质代谢相关酶FASN、ACLY、SREBP-1 的表达，从而抑制肿瘤的发生和转移。此外，蟾毒灵能够抑制肝癌细胞的脂肪酸β氧化速率，能够调控肝癌细胞与PBMC共培养模型中多种趋化因子的表达，但具体的作用机制有待进一步研究。ACOX2是一个脂肪酸氧化酶，本研究通过构建ACOX2过表达的稳转株，CCK8绘制生长曲线、Annexin V/PI双染法流式检测细胞凋亡、Transwell检测细胞迁移、侵袭能力，观察ACOX2过表达对肝癌细胞生物学行为的影响；4D非标记定量蛋白质组学比较肝癌细胞过表达ACOX2前后的蛋白表达谱差异。在人肝癌组织样本中检测及分析ACOX2 mRNA表达水平、蛋白表达水平，及其表达水平与患者临床病理特征、预后的关系。分析肝癌组织样本中ACOX2的表达与CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞分布的关系。结果显示，肝癌细胞中过表达ACOX2对肝癌细胞增殖无明显影响，能够促进肝癌细胞PLC/PRF/5的凋亡，抑制肝癌细胞的侵袭转移。4D非标记定量蛋白质组学显示过表达ACOX2引起的差异蛋白主要涉及甲基支链脂肪酸代谢、脂肪酸氧化等生物进程，葡萄糖醛酸基转移酶活性、亚铁结合等分子功能，突触后膜整、浆膜、线粒体膜、脂滴等细胞组分。与癌旁组织相比，ACOX2在肝癌组织中表达降低。与ACOX2 低表达患者相比，ACOX2在肝细胞癌组织中高表达患者的OS更长。肝癌组织中ACOX2的表达与CD4、CD8阳性细胞的表达呈正相关（P<0.005）。研究发现过表达ACOX2并不能逆转蟾毒灵对肝癌细胞脂肪酸β氧化的抑制作用，过表达ACOX2反而降低了肝癌细胞的脂肪酸β氧化速率，与最初预期不符，蟾毒灵抑制肝癌细胞脂肪酸β氧化的机制有待进一步探索。总体，进一步明确了ACOX2在肝细胞癌中的功能及作用机制，深化了蟾毒灵的抗肝癌机制，为以蟾毒灵为主要抗肿瘤活性成分的药物的临床应用提供实验依据。