11家族木聚糖酶嗜碱分子机制研究

Xylanase is the key enzyme that can degrade xylan, the major component of hemicellulose. It has potential industrial applications in the pulp bleaching process, baking industry, animal feed preparation and biological degumming industry and so on. Because of smaller molecular mass and cellulase-free activity, family 11 xylanases are more suitable in pulp bleaching process. The xylanases used in the paper industry are required to be stable and active at high temperature and alkaline pH. Investigators have carried out a lot of researches on the thermophilic mechanism of family 11 xylanases which can contribute to improve the thermophilicity of mesophilic enzyme for industrial applications. However, little is known about molecular mechanism of alkaline adaptation of family 11 xylanases. In this study, we will collect structure information of all pH-dependant activity known and mesophilic family 11 xylanases. By structural comparison of acidophilic, neutral and alkaline enzyme, structural features of pH-dependant activity of family 11 xylanases will be systematically studied. In addition, site-directed mutageneses and random mutation of alkaline xylanase Xyn11A-LC will be performed in order to further investigate the molecular mechanism of pH-dependant activity of family 11 xylanases. This study will not only deepen the understanding of molecular mechanism of alkaline adaptation of enzyme, but also contribute to engineer the enzyme to be active at higher pH condition for industrial application in the pulp bleaching process.

木聚糖酶是降解半纤维素主要成分木聚糖的关键酶，广泛应用在食品、饲料、制浆造纸、生物脱胶等行业。其中11家族木聚糖酶由于无纤维素酶活性及分子量小，更适合用于纸浆漂白领域。纸浆漂白工艺中需要酶在高温碱性条件下发挥作用，目前在11家族木聚糖酶嗜热机制研究方面取得了一定的进展，为提高木聚糖酶的热稳定性奠定了基础，但对于其嗜碱的分子机制尚未有系统的研究。本课题拟从进化角度，通过对11家族的碱性、中性和酸性木聚糖酶结构的比较，寻找碱性酶碱适应的结构基础；通过对活性中心周围氨基酸的分析，寻找影响酶的嗜碱性的关键位点，并对其定点突变验证，进一步结合随机突变技术，分析单个位点对酶的嗜碱性的影响机制。本课题通过对11家族木聚糖酶嗜碱分子机制的系统研究，可以为基于应用于纸浆助漂而提高11家族木聚糖酶嗜碱性的分子改造奠定基础，为定向进化的结果提供理论依据，丰富对酶的嗜碱机制的认识。

木聚糖酶是降解植物半纤维素主要成分木聚糖的关键酶，在食品、饲料、制浆造纸、生物脱胶等行业具有巨大的应用潜力。其中11家族木聚糖酶由于无纤维素酶活性及分子量小，更适合于纸浆漂白领域。纸浆漂白工艺中需要酶在高温碱性条件下发挥作用，因此嗜碱机制的研究有利于指导提高酶的嗜碱性的分子改造，目前尚未有其嗜碱的分子机制尚的系统研究。.本课题从进化角度，通过对11家族的碱性、中性和酸性木聚糖酶结构的比较，获得碱性酶碱适应的结构基础；通过对活性中心周围氨基酸的分析，获得影响酶的嗜碱性的关键位点，并对其定点突变验证，进一步结合随机突变技术，分析单个位点对酶的嗜碱性的影响机制。.通过结构比较，获得了嗜碱的结构基础，即碱性木聚糖酶含有高比例的负/正电荷比，降低了Ser、Thr和Tyr比例；在β6和β7之间，碱性木聚糖酶用α-螺旋替代了非碱性酶中的β转角或无规则卷曲；碱性木聚糖酶含有一段7个富含电荷的氨基酸loop，有利于酶在碱性条件下发挥活性；表面带正电荷的氨基酸及离子键对酶的碱性催化活性起重要作用。通过结构比较、序列比对及突变分析，获得影响11家族木聚糖酶嗜碱性的关键位点：Glu16、Trp18、Asn44、Leu46、Arg48和Ser187。该6个氨基酸可能通过改变电荷、氢键网络或屏蔽溶剂等方式改变催化氨基酸的解离常数，使Xyn11A-LC保持在较高pH条件下发挥活性。构建随机突变文库及位点饱和突变，获得最适pH提高1个单位的突变体E135R；结构分析表明Glu135位于蛋白表面的八氨基酸环部，可能通过消除该位置的负电荷及盐桥的形成，提高了酶的嗜碱性及催化活性。通过表面引入Arg，获得嗜碱性进一步提高的突变体D89R和E109R，与野生型相比，双位点突变体的最适pH提高0.5个单位。进一步证明，表面正电荷有利于11家族木聚糖酶的嗜碱性的提高。.本课题通过对11家族木聚糖酶嗜碱分子机制的系统研究，可以为基于应用于纸浆助漂而提高11家族木聚糖酶嗜碱性的分子改造奠定基础，为定向进化的结果提供理论依据，丰富对酶的嗜碱机制的认识。