黄瓜果实苦味基因Bt的克隆

黄瓜（Cucumis sativus L.）是我国重要的蔬菜作物，果实苦味是影响黄瓜生产的问题之一。黄瓜苦味受复杂的遗传控制，控制营养体和果实苦味的基因之间存在互作效应。导致黄瓜苦味的化学物质是葫芦素。由于缺乏合适的试验材料和必要的基因组序列信息，黄瓜葫芦素合成代谢的分子机制缺乏深入研究。国际黄瓜基因组计划（CUGI）所测得的全基因组序列信息为快速克隆目的基因提供了条件。本项目拟在成功分离控制黄瓜营养体苦味基因Bi的基础上，使用纯合的Bi材料构建控制果实苦味形成的关键基因Bt的分离群体，开展Bt在果实苦味形成中的功能研究。项目将充分挖掘和利用全基因组测序信息，快速实现Bt的精细定位并获得候选基因，通过转基因验证功能。本研究拟通过高效率的技术路线来挖掘黄瓜果实苦味形成的关键基因，对于明确果实苦味形成机制具有重要意义，可以为黄瓜无苦味品种选育提供理论依据。

利用果实苦味和果实不苦的纯合黄瓜自交系46GBt和931为亲本建立遗传群体，结合2112对基于全基因组测序设计的SSR引物，构建了果实苦味Bt基因的SSR连锁群。该连锁群包含8个SSR标记，与Bt基因最近的两侧标记为SSR10795和SSR07081，遗传距离分别为0.8cM 和2.5cM。通过与先前发表的高密度图谱比较，将Bt基因初步定位在黄瓜5号染色体短臂一端3.3cM的范围内。在对46GBt和931重测序的基础上，利用生物信息学分析双亲在初步定位区域的序列差异，设计了7对InDel标记。通过对F2群体分析，获得了与Bt基因连锁距离为0.8cM的Indel标记Bt-InDel-1。并将Bt基因进一步定位在标记SSR10795和SSR15564之间，遗传距离分别为1.0 cM和0.3cM。接着利用这两个两侧翼标记，对包含1315个F2单株的扩大群体进行SSR分析，筛选出50个具有8种不同重组形式的重组单株。Bt基因被精细定位在标记SSR02118和SSR15564之间1.5cM的范围内，遗传距离分别为1.1cM和0.4cM。通过对两标记之间的区域进行序列分析，发现该区域物理距离为300Kb，预测了31个候选基因，并明确了这些候选基因在染色体上的排列位置。其中，基因Csa012474编码转运蛋白，是优先考虑的候选基因，获得了该基因的序列和预测功能。经验证，SSR标记SSR10795和SSR07081用于分子标记辅助选择（MAS）的正确率均为91.6％，Indel标记Bt-InDel-1的正确率达到94.8%，对于黄瓜果实无苦味MAS育种将发挥重要作用。项目执行过程中，发表学术论文4篇（含SCI论文1篇，国际会议1篇，一级学报2篇）；申请国家发明专利1项；培养了1名博士和1名硕士。. 值得注意的是，在本研究开展过程中，发现并首次报道了存在于欧洲温室类型黄瓜中的Bi-3基因。这为在本基金项目研究成果的基础上，更深入探明黄瓜苦味形成的遗传分子机制奠定了坚实基础。