铜伴侣蛋白PcoC调控铜稳态的作用机制研究

Copper is an essential element required for all living organisms. In the metabolic balance of copper, copper chaperones play an important role. The copper-resistance proteins PcoC from E. coli is an unusual protein with two separated binding sties specific for Cu(I) and Cu(II). The PcoC may be as a “redox switch” to regulate copper. This application proposed the hydrophobic barrel of PcoC play a key role in the copper transfer process. Molecular biology methods were used to express and purify the PcoC and its mutant. The computer simulation method was used for screening appropriate molecule blocking the hydrophobic barrel. The thermodynamics and dynamics properties of PcoC and mutants binding with metal ions were measured through fluorescence spectra, UV spectra and isothermal titration calorimetry methods. The oxidation properties of Cu(I)-PcoC and the reduction properties of PcoC-Cu(II) in the different forms of PcoC were observed. The research provides some chemistry theory basis for illustrating the PcoC copper regulation mechanism. It has great significance for prevention and control copper metabolic diseases.

铜是生物体必须的微量元素。在铜的代谢平衡中，铜调控蛋白起重要作用。PcoC是从含铜抗性基因的大肠杆菌中得到的少见的可结合Cu(I)、Cu(II)的铜调控蛋白，其可能作为氧还开关参与铜的调控，但分子机理尚不清楚。本项目提出PcoC疏水桶在Cu(I)氧化后由Cu(I)位点向Cu(II)位点迁移过程中起重要作用的思路，通过分子生物学方法得到PcoC及可堵塞疏水桶的突变体；用计算模拟手段筛选可堵塞疏水桶的小分子；用光谱、等温量热滴定等方法研究PcoC及突变体与Cu(I)、Cu(II)等金属离子的结合性质，可堵塞疏水桶的小分子与PcoC的作用机制；对比疏水桶堵塞前后 Cu(I)-PcoC或PcoC-Cu(II)的氧化或还原性质；阐明铜在PcoC的Cu(I)、Cu(II)位点之间的迁移过程。为PcoC铜调控机理的阐明提供化学理论依据，对铜代谢疾病的防治等具有重要意义。

铜是生物体必须的微量元素。在铜的代谢平衡中，铜调控蛋白起重要作用。PcoC是从含铜.抗性基因的大肠杆菌中得到的少见的可结合Cu(I)、Cu(II)的铜调控蛋白，其可能作为氧还开.关参与铜的调控，但分子机理尚不清楚。本项目以PcoC疏水桶在Cu(I)氧化后由Cu(I)位点向Cu(II)位点迁移过程中起重要作用为思路，首先通过分子生物学方法完成了PcoC及突变体的构建、表达及分离纯化。经宝生物大连有限公司测序及SDS-PAGE证实所得蛋白为PcoC蛋白。通过荧光光谱、紫外光谱及配体竞争法研究了PcoC与金属离子Cu(II)、Ag(I)和Hg(II)结合的热力学性质，得到铜与蛋白质结合的条件稳定常数数量级达到1013。通过化学变性手段阐明了金属离子对PcoC结构稳定性的影响，结果表明，铜离子的结合使得蛋白质的稳定性大幅度增加，并且出现了一个稳定的中间态。通过表面活性剂CTAB也可以得到该中间态。该中间态结合Cu(II)的能力与天然态相比基本不变。时间分辨各向异性、化学变性及分子模拟表明中间态的结构为蛋白质的C端发生解折叠，而N端结构的稳定性基本没受影响。其次，探究了小分子TCPP、姜黄素、血红素及白藜芦醇与蛋白质的相互作用。结果表明小分子与蛋白质作用后使得蛋白质的结构稳定性降低。荧光光谱、紫外光谱及分子对接表明小分子TCPP、姜黄素、血红素及白藜芦醇的结合位点位于蛋白质的两端。最后，初步探究了疏水桶堵塞前后Cu(I)-PcoC-Cu(II)的氧化还原特性，结果表明，PcoC 86位的丙氨酸突变为甲硫氨酸后，与桶中67位的甲硫氨酸形成Cu(I)的弱结合位点。桶中央弱结合位点的形成使得突变体的还原速率降低。这也说明，位于蛋白质N端的Cu(II)在还原剂的存在下还原为Cu(I)可能是经过疏水桶中到达C端的。阐明铜在PcoC的Cu(I)、Cu(II)位点之间的迁移过程，为PcoC铜调控机理的阐明提供化学理论依据，对铜代谢疾病的防治等具有一定的意义。.