利用NNT系统及"后差减剔除"技术克隆与黑麦抗逆相关的重要调控基因

核蛋白是一类在细胞质内合成、定位于细胞核内的蛋白质，在植物逆境胁迫响应等生理过程中发挥着重要的调控作用。申请人前期自主成功建立了以酵母的遗传体系为基础的核蛋白筛选系统（NTT），并已构建好干旱处理及未干旱处理的小麦近缘属黑麦cDNA文库。本项目拟利用NTT系统及"后差减剔除"相结合的方法对该文库进行筛选，对所得克隆进行测序、生物信息学分析后，确定候选基因（2-4个），运用Race的方法获得其全长cDNA序列；利用Real-time-PCR、亚细胞定位及酵母单杂交技术对候选基因进行表达、细胞定位及转录激活等特性分析；并结合农杆菌介导法转化烟草进行功能鉴定，从而获得与抗逆相关的重要调控基因。这不仅为利用基因工程改良植物的抗逆性提供具有自主知识产权的基因资源，而且对于了解黑麦在干旱条件下核蛋白的构成、剖析抗逆调控网络具有重大的理论与实践意义。

核蛋白在植物生长、发育、胁迫响应及代谢途径中发挥重要作用。且对基因表达调控具有重要作用，但核蛋白在细胞核中聚集是动态过程，至今尚无有效的检测在胁迫处理前后核编码蛋白的差异情况。本项目创建了一种综合筛选核编码蛋白的方法，其包含NTT系统及后差减剔除方法。并建立了高效的酵母转化体系，可以有效的对植物胁迫处理前后差异核编码蛋白进行筛选。该系统以pLexAD为筛选载体骨架，同时结合后差减剔除方法使其筛选差异表达的核蛋白特异性更强。. 本项目用该系统对黑麦的正常与干旱、低温处理5h cDNA文库进行了筛选。其中在低温文库筛选中，共获得357个差异表达蛋白，其中275个已知蛋白，82个未知蛋白；在275个已知蛋白中，212个为编码全长或部分蛋白，其预测均具有核定位信号。基于GO分类，275个已知蛋白中序列特异性DNA结合转录活性因子占31%，表明该方法对核蛋白的筛选具有较高效率。其中的四个蛋白：ScT1（热休克蛋白）、ScT36（MYB类转录因子）、ScT133（ERF类转录因子）、ScT196 （未知蛋白）进行洋葱亚细胞定位分析表明其定位于细胞核。Q-RT-PCR分析表明均对低温胁迫具有响应。过量表达ScT1及ScT36基因的转基因拟南芥，功能分析表明转基因植株的耐高温及耐低温胁迫能力得到明显提高。. 因此，本项目的完成，为筛选核蛋白提供了一种新的方法与思路，并获得优异的抗逆新基因资源。