滋阴补肾片调控Nrf2/ARE信号通路抑制视网膜氧化损伤治疗年龄相关性黄斑变性的机制研究

Oxidative damage and decreased antioxidant ability leads to RPE dysfunction and structural abnormalities is the recognized initiating factors and important pathology of age-related macular degeneration (AMD). ZiyinBushen tablet can npurishing yin and supplementing kidney. It has been found it has a good effect on retinal oxidative damage such as AMD, but the mechanism is still to be studied.This study selects the anti oxidative damage and aims at Nrf2/ARE as a key oxidative stress protection pathway，we established the animal and cell model of retina oxidative damage .The detection of retina morphology and function , cell viability and antioxidant level are examinated to observe the protective effect of ZiYinBuShen tablet on oxidative damage in the retina; Through determination of Nrf2/ARE pathway and underneath target gene expression to demonstrate the role of Nrf2/ARE pathway in retinal oxidative injury in the role; Through inhibitor technology to opposite elaboration the protection of ZiYinBuShen tablet against oxidative damage based on mediated Nrf2/ARE signal pathway. Combine the in vivo and in vitro analysis, positive and negative cross validation to reveal the molecular biology of ZiYinBuShen tablet in the treatment of AMD, and deepen the theoretical framework and scientific connotation of the treatment of AMD by traditional Chinese Medicine.

氧化损伤及抗氧化能力的下降导致视网膜色素上皮细胞功能障碍及结构异常是年龄相关性黄斑变性（AMD）公认的始动因素和重要病理改变。滋阴补肾片补益肝肾，前期临床实验证实了其对AMD有着良好疗效，细胞学实验证实了该药具有保护RPE抗氧化损伤的作用，但作用机制尚待进一步研究。本课题瞄准Nrf2/ARE这一关键氧化应激保护通路，建立视网膜氧化损伤的动物和细胞模型，通过细胞活力及抗氧化水平、视网膜形态学检测论证滋阴补肾片对视网膜氧化损伤的保护作用；通过测定Nrf2/ARE通路及下游靶基因的表达明确Nrf2/ARE通路在视网膜氧化损伤中的作用；在此基础上通过特异性通路抑制剂反面论证滋阴补肾片通过上调Nrf2/ARE通路以达到保护视网膜抗氧化损伤的目的。体内外实验结合、正反交叉验证，揭示滋阴补肾片治疗AMD的分子生物学机制，深化中医药治疗AMD的理论框架和科学内涵。

本课题通过在体离体实验研究滋阴补肾片调控Nrf2信号通路在NaIO3诱导SD大鼠干性年龄相关性黄斑变性及H2O2诱导的RPE细胞氧化损伤中发挥的作用，探讨滋阴补肾片治疗干性年龄相关性黄斑变性的可能机制。在体实验，通过建立NaIO3诱导SD大鼠干性年龄相关性黄斑变性的模型，通过病理学检测和TUNEL及免疫荧光检测研究细胞凋亡状态：HE染色显示RPE与感光细胞层屈曲，感光细胞层部分缺失；电镜结果显示RPE细胞内脂褐素的聚集，Bruch膜厚度不均一，凋亡显著增高（P<0.05）,但滋阴补肾片干预后显著改善视网膜细胞凋亡（P<0.01）及视网膜的各层结构；滋阴补肾片可以降低ARPE-19细胞及大鼠血清中ROS、MDA的含量（P<0.01），同时可提高ARPE-19细胞及大鼠血清内SOD、GSH-Px的表达水平（P<0.01）；PCR结果显示滋阴补肾干预组可显著增加Nrf2、HO-1的表达（P<0.01）；WB及细胞免疫荧光结果显示滋阴补肾片可刺激Nrf2核转移，显著增强细胞核内Nrf2表达并激活下游的HO-1表达（P<0.01）。离体实验通过建立H2O2诱导人ARPE-19细胞氧化应激损伤模型，制备滋阴补肾片含药血清，分别设置空白对照组，H2O2模型组，三个浓度含药血清干预组（0.5%，1%，2%）。CCK-8及TUNEL测定细胞活性及凋亡；免疫荧光、Western-blot方法检测Nrf2，HO-1的蛋白表达水平，并探索滋阴补肾片可能参与的抗氧化应激反应的信号通路。PCR结果显示滋阴补肾片干预组可显著增加Nrf2、HO-1的表达（P<0.01）。WB及细胞免疫荧光结果显示，滋阴补肾片可刺激Nrf2核转移，显著增强细胞核内Nrf2表达并激活下游的HO-1表达（P<0.01）。本实验组还通过网络药理学方法采用Metascape平台分析“药物-成分-靶点”及其参与的生物过程及通络，而后采用Cytoscape3.8.1软件构建“滋阴补肾片成分- dry AMD靶点-通路”网络。滋阴补肾片治疗dry AMD的核心活性成分为槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素等。核心靶点有AKT1、PTGS1、TNF、JUN、BCL2、CASP3、PIK3CG、AR、BAX等。