基于转录组(RNA-Seq)技术的矮岩羊体型矮化的遗传学研究

Blue sheep (Pseudois nayaur) is the only species of Pseudois, Bovidae, and dwarf blue sheep is an unique variable population belonging to blue sheep. These two have distinct features in body figures, habitats and diet. In particular, they have remarkable differences in body figure: the weight and body size of dwarf blue sheep is only half of that of blue sheep. This stably inherited .differences in trait leads to significant controversy on classification of dwarf blue sheep in the genus Pseudois. We will use RNA-seq (whole-exome sequencing) to determine the sequence and expression level of all genes from cDNA extracted from blood and muscle tissues of both dwarf blue sheep and blue sheep. Whole-exome sequencing is not only able to globally analyze differential gene expression profile between dwarf blue sheep and blue sheep, but also to search for specific gene mutations responsible for affecting gene expression and function. It is a powerful tool to screen and analyze target genes that regulate the mutating body figures of dwarf blue sheep. Analysis of transcriptome of dwarf blue sheep enables more thorough investigation of taxonomic status of dwarf blue sheep through high throughput sequencing, and provides strong evidence for sympatric speciation, which is an important field in evolutionary biology..

岩羊是牛科岩羊属中仅有的一个物种，而矮岩羊则是该物种内部一个非常独特的变异群体。二者在体型、生境、食性等方面存在诸多差异，尤其是体型的差异非常明显，矮岩羊的体长和体重通常只有岩羊的一半左右，这种能够稳定遗传的形态差异使得矮岩羊在岩羊属内的分类地位一直存在很大的争议。本项目中我们将采用转录组测序(RNA-Seq)技术对矮岩羊和岩羊血液和肌肉组织中表达的所有基因的cDNA序列和表达丰度进行测定，这项技术既可以从宏观上分析二者间的整体基因表达差异情况，又可以从微观上寻找影响特定基因转录水平的突变位点，是对导致矮岩羊体型变异的关键基因进行筛选和分析的有力工具。矮岩羊转录组的研究不仅是从高通量数据水平更全面地探讨矮岩羊分类地位问题，还可以为同域物种形成(Sympatric speciation)这一重要进化生物学命题提供有力的分子证据。

在大型哺乳动物中，矮岩羊是体型变异的代表性动物，也是同域物种分化的典型例证。研究其形态变异的遗传机制将对同域物种分化的探究产生深远影响。本研究，我们通过非损伤性取样分别提取了3只岩羊和3只矮岩羊的肌肉组织RNA，利用RNA-Seq技术构建了RNA转录组文库。通过高通量测序和表达序列标签，对reads进行从头组装，得到长度逐渐增加的contigs和unigenes，并将两文库的unigenes混合进一步组装成一个具有20348 unigenes的all-unigenes。两个文库间有5678个unigenes差异表达。与矮岩羊相比，在岩羊文库中有3053个unigenes表达上调，2658个表达下调。最终有17156个基因被成功注释。首先，我们通过文库筛选了部分核基因SSR和SNPs标记对岩羊和矮岩羊群体进行了遗传分化分析，结果显示岩羊和矮岩羊之间遗传差异较小，存在基因交流，尚达不到物种分化的标准。这一结果也是与之前的线粒体基因分析结果一致，故我们认为矮岩羊和岩羊仍属同一物种。其次，通过KEGG分析，我们发现富集于“MAPK”和“Protein processing in endoplasmic reticulum ”通路中分布的all-unigenes最多。这些通路也与细胞的生长发育有密切的联系。我们从两组间筛选了26个表达差异最大的基因进行heatmap分析，发现AKT、Mb、CAM、AKT、GATA6、TIMP1、MMP和AMPK这七个基因对于岩羊和矮岩羊分组的贡献最大。其中，AKT和CAM两个基因在组间的表达差异最大。这两个基因也是细胞增殖分化中的重要调节因子。此外，我们还在矮岩羊GDF9基因的3’-UTR中发现了一个17bp的Indel，通过荧光素报告酶系统的检测，这个缺失导致岩羊和矮岩羊GDF9的基因表达存在显著差异，这也从另外一个角度揭示了microRNA在肌肉骨骼发育中存在重要调控的作用。综上所述，矮岩羊体型虽与岩羊同属一个物种，遗传差异较小，但是体型矮化则是由生长发育相关基因的表达差异引起的，与生境的改变没有直接联系。这种稳定的遗传差异可能随着进化的推演逐渐增大，最终导致同域物种的形成，这为大型哺乳动物的物种形成方式提供新的视角和例证。