靶向调控Notch通路的 Cell Sheet 联合PTH促进异体骨修复骨缺损的作用及机制研究

Critical sized bone defects is still a major challenge in the field of orthopaedic surgery. Theoretically，if the chondrogenic, osteogenic and angiogenesis property of bone-marrow derived stromal cells (BMSCs) could be enhanced in the bone remodeling, bone defect healing during skeletal repair can be promoted. In our previous study, we illustrate the ability of BMSCs sheets to act as an engineered periosteum that promotes bone callus formation during allograft healing and integration in a preclinical mouse model of critical sized femoral allograft. Additionally, it is reported that intermittent PTH could increase not only the bone mass but also small vessels in the sites of new bone formation, but the biology mechanisms by which PTH induced angiogenesis remain unclear. Therefore，our study try to determine whether transient Jagged1-mediated NOTCH signaling could promote human BMSCs (hBMSCs) maintenance and expansion in vivo, while preserving their skeletogenic differentiation capacity, and explore the effect of allografts wrapped with NOTCH-mediated hBMSCs Sheet combined with PTH on the allograft healing. Specially, both vitro and vivo experiments will be conducted to clarify the molecular and signaling mechanism underlying the role of PTH on angiogenesis in the process of bone healing. The accomplishment of our study will provide a favorable approach and insight for the treatment of massive allograft healing.

骨缺损修复是骨科面临的十分棘手的挑战。若能根据骨修复的需求，调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖、定向分化及骨缺损周围血管的形成，即可促进骨缺损的修复、愈合。我们前期研究证明，Notch通路可以调控BMSCs的增殖与分化, Cell Sheet作为组织工程骨膜可以促进结构性异体骨修复骨缺损。近期报道，甲状旁腺素(PTH)不仅可以促进骨折愈合，而且可以促进骨活跃区的血管生成，但其调控机制尚不明确。因此，我们拟在体外靶向Notch配体Jagged1激活BMSCs Notch通路，获取稳定扩增、维持分化潜能的BMSCs，培养成Cell Sheet, 探讨靶向激活Notch通路的Cell Sheet作为组织工程骨膜联合PTH促进异体骨修复骨缺损的作用及分子机制。同时，通过体内、体外实验，明确和归纳PTH调控骨重建过程中血管形成与分布的机制。本课题为骨缺损修复的研究及治疗提供了崭新的思路和方法。

外伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病等原因造成的大段骨缺损的治疗一直是骨科的难题和研究热点。根据骨修复的需求，如若可以供同自体骨一样包含的干细胞、生长因子和小血管的微环境, 即可促进骨缺损的修复、愈合。我们前期研究证明，Notch通路可以调控BMSCs的增殖与分化，Cell Sheet作为组织工程骨膜可以促进结构性异体骨修复骨缺损。近期报道，甲状旁腺素(PTH)不仅可以促进骨折愈合，而且可以促进骨活跃区的血管生成，但其调控机制尚不明确。针对对于BMSCs细胞体外培养过程中极易失去其多向分化的能力的问题，本课题我们首先在体外靶向Notch配体Jagged1激活BMSCs Notch通路，获取稳定扩增、维持分化潜能的BMSCs，此方法可以快速获取稳定扩增并维持BMSCs成软骨和成骨分化潜能，解决了干细胞临床应用的一个关键问题。然后，利用此方法将干细胞培养成Cell Sheet。研究证实在体外培养激活BMSCs Notch通路可以短时间获取大量的BMSCs，并维持BMSC的分化潜能。体内研究发现靶向激活BMSCs Notch通路形成的Cell Sheet作为组织工程骨膜可以有效的促进异体骨修复骨缺损。另一方面，Cell Sheet技术联合PTH可以促进异体骨修复大段骨缺损。通过体外实验证实PTH对破骨细胞分化无直接的作用，但在体内可以有效调控骨重建过程中破骨细胞的活化，从而促进骨改建过程。课题最后证实PTH在体内可以促进骨修复过程中血管的形成。本课题为骨缺损修复的研究及治疗提供了崭新的思路和方法。但是，作为制备Cell Sheet的干细胞，其来源非常复杂，制备工艺及控制指标都不尽相同，很难实现标准化。部分从事干细胞治疗的机构，并不具备国家规定的卫生主管部门批准的资质，擅自开展干细胞移植技术。因此，Cell Sheet技术应用于临床实践依然有很长的路要走。