拷贝数变异在中国遗传性耳聋人群中的分布及筛查策略研究

The genetic heterogeneity of non-syndrome hearing loss (NSHL) is very high, therefore target genome enrichment coupled with high throughput sequencing has been implemented for mutation screening of NSHL. However, previous studies using high throughput sequencing strategies focused on identifying point mutations and small INDELs, while neglecting the gene copy number variations (CNV). CNV could cause hereditary hearing loss, however, due to the limited resolution or the high price, the classic CNV screening methods is not suitable for identifying CNVs in hearing loss genes. This project intends to screening for small mutations and CNVs simultaneously using ultra multiplex PCR and high through put sequencing technics (Ampliseq). We will making CNV callings using the depth of coverage data generated by Ampliseq, then verify the CNV callings using real-time quantitative PCR, and breakpoint mappings. The primers used in Ampliseq will be optimized by sequence architecture analysis of hearing loss genes. This study will provide experimental basis for establishing a more efficient and more comprehensive mutation screening strategy for hereditary hearing loss.

非综合症型耳聋（NSHL）具有很高的遗传异质性，因此基因组靶向捕获和高通量测序已成为耳聋突变筛查的有效方法。然而，以往的研究在分析高通量测序数据时大多只侧重于发现点突变和小片段插入缺失，却忽略了耳聋基因的拷贝数变异（CNV）。CNV与遗传性聋密切相关，然而限于分辨率和成本等因素的制约，经典方法不适用于耳聋基因CNV的筛查。本项目拟应用多重PCR扩增结合高通量测序的方法（Ampliseq），实现耳聋基因点突变和CNV的同步筛查。我们将使用Ampliseq产生的覆盖倍数数据进行CNV calling，采用实时定量PCR、断裂位点定位验证Ampliseq检测CNV的可靠性；并结合生物信息学方法分析耳聋基因序列，预测CNV热点区域，对靶向捕获方案进行优化，提高Ampliseq检测CNV的准确度和效率。本研究将为建立更全面的遗传性聋突变筛查策略提供实验基础。

遗传性聋具有高度的基因异质性，已知的非综合症型耳聋基因共有112个。因此高通量的检测方法，例如SNP 芯片和高通量测序，已经应用于耳聋的突变筛查。现有的耳聋突变高通量筛查策略往往忽略了CNV 的贡献，导致对已知耳聋基因CNV 分布和突变频率的认识十分有限。高通量测序已经成为耳聋突变筛查的常用手段，通过数据分析不仅能发现点突变和小片段的插入缺失等变异，还可以检测大片段的CNV，我们采用了全外显子测序、CNV芯片、低覆盖度全基因组测序、MLPA等方法对CNV进行检测，并比较各种技术的优劣。研究分一下几个方面进行：.1. 应用高通量测序检测散发和家系非综合症型耳聋突变。.1）收集临床散发和家系非综合症型耳聋病例，详细记录患者临床数据。.2）抽取静脉血3～5ml，提取基因组DNA，对中国人群最常见的耳聋突变位点进行排除。.3）对于排除了常见突变位点的患者进行全外显子测序，并分析点突变和小片段的插入缺失。.4）分析全外显子组数据中的CNV，对CNV进行验证。.5）对剩余病例进行MLPA检测.6）对剩余病例进行CNV芯片检测。.（2）取得的主要研究进展、重要结果、关键数据等及其科学意义或应用前景。.主要发现：.1）CNV是中国耳聋人群重要的致病因素.2）中国人群的CNV变异主要集中在STRC、OTOA、USH2A等基因中，其中STRC的频率最高.3）全外显子测序数据可以用于检测大片段的CNV，但是对于小片段的变异灵敏度较低.主要数据：.在121名耳聋患者中，检测到3例STRC基因CNV变异，2例OTOA基因CNV突变，1例USH2A基因CNV突变。.