金属响应转录因子调控平菇漆酶基因表达的分子机制

As an important component of the extracellular ligninolytic enzymes of white-rot fungi, laccases show significant application on bio-degradation and environmental remediation. Metal irons have universal regulation on the laccase gene of whit-rot fungi. There are at least two kinds of cis-acting elements on the upstream region of laccase gene that are directly related to laccase regulation by metal irons. They are ACE and MREs (metal-responsive elements) cis-acting elements, respectively. But the studies focus on the transcription factors in Pleurotus ostreatus are not enough, the information about the transcription factors and the regulation mechanism is very limited. This study tries to screen the key transcription factors that interact with ACE and MREs in white-rot fungus Pleurotus ostreatus HAUCC 162 by yeast one-hybrid system, and subsequently investigate the special interaction between the transcription factors and the aforementioned cis-acting elements. At last, we will reveal the expression level and distribution pattern of the transcription factors in P. ostreatus, and to find the possible co-activators of the transcription factors, to preliminarily clarify the molecular mechanism of the regulation of laccase gene by these transcription factors.

漆酶是白腐真菌特异胞外降解酶系中的重要组分，在生物降解和环境修复领域有着重要的应用价值。金属离子对于白腐真菌漆酶有着普遍的调控作用，漆酶基因上游调控区存在至少两类与金属离子调控直接相关的顺式作用元件，即ACE结合元件和金属离子响应元件MREs（metal-responsive elements），而对与之发生作用的转录因子的研究在平菇中开展得并不深入，目前尚不清楚平菇中相应转录因子的种类及其调控漆酶基因表达的分子机制。本研究拟采用酵母单杂交技术在平菇Pleurotus ostreatus HAUCC 162中筛选与ACE结合元件和MREs响应元件互作的转录因子，研究DNA元件与转录因子的特异作用，探究金属离子诱导条件下转录因子表达水平的变化规律及其在细胞内的分布规律，寻找细胞中可能与金属响应转录因子发生作用的辅助激活因子，初步揭示P. ostreatus转录因子调控漆酶基因表达的分子机制。

漆酶是白腐菌特异胞外降解酶系中的重要组分，在生物降解和环境修复领域有着重要应用价值。前期研究发现部分金属离子尤其是铜离子，对白腐菌P. ostreatus胞外漆酶有着极其显著的诱导效应，但目前对这种诱导的机制并不清楚。因此筛选其响应金属铜离子调控漆酶表达的转录因子，有助于揭示漆酶基因表达调控的分子机制。.首先，项目以Lac启动子上包含ACE结合元件和金属离子响应元件的一段361bp序列构建了酵母诱饵质粒和菌株。利用SMART接头技术构建铜离子诱导下P. ostreatus的cDNA文库并转化酵母诱饵菌株，筛选可能与上游调控序列互作的转录蛋白。最终共获得近1000个酵母阳性克隆子，其中存在潜在的与调控序列互作蛋白，该结果为筛选关键转录蛋白奠定了扎实基础。.同时，项目利用转录组学技术解析了铜离子诱导下P. ostreatus基因表达及代谢网络。结果表明，其通过降低脂代谢，过氧化物酶体等以减弱铜离子的毒害作用，同时提高线粒体自噬、β-黑色素代谢、硫代谢水平维持机体所需基本物质和能量。深入分析发现，共有90个转录因子表达水平发生显著变化，如ACE1和MTF-1同源的zf-C2H2类转录因子，表明转录因子在基因表达网络改变中发挥重要作用。进一步筛选发现6个ACE1和MTF-1同源蛋白（rna2993、rna182、rna9285、rna9321、rna267和rna9286）能够显著响应铜离子诱导，表明这些蛋白可能在铜离子诱导下的转录调控中起重要作用。酵母单杂交文库筛选和组学技术的综合应用，能够辅助我们对关键转录调控子快速定位。.此外，项目对P. ostreatus漆酶同工酶环境应用潜力进行了深入研究，揭示了漆酶对于环境污染物氯酚、硝基酚、磺胺的降解能力及机制，概括了不同漆酶同工酶在染料降解特性上的差异及机制。结果表明P. ostreatus漆酶具备优良的环境修复能力，其半纤维素酶也具备优良的木质纤维素高值化利用潜力。.综上，本项目构建了一个高质量、高丰度的酵母单杂交文库，结合组学技术，筛选获得了6个潜在响应铜离子的漆酶转录调控蛋白，并初步解析了转录因子介导的P. ostreatus响应铜离子胁迫的机制。项目的实施，为深入解析金属离子调控白腐菌漆酶及木质素降解酶基因表达的分子机制奠定了基础，为揭示白腐真菌漆酶高效合成规律、实现白腐真菌在环境修复领域的应用提供了有价值的新信息。