沙冬青脱水素基因家族的功能性进化研究

Ammopiptanthus monogolicus is the only evergreen broadleaf shrub endemic to the Alashan desert, northwest sand area of China, where the climate is arid, the site is desertification and salinization and the temperature is blow -30℃ in winter, up to 40℃ in summer.This species also demonstrates remarkable drought, salt, and alkali resistant capacities and forms typical super-xerophytic structure.Originating from the Tertiary geologic time and situating long in adverse environments, A. mongolicus has gradually evolved typical superxeromorphic structures and molecular metabolic characteristics to adapt the adversity, such as drought, salinization, cold, heat and other stresses. Tolerance to diverse adversities makes A. mongolicusan an excellent model of woody plant for the study of molecular mechanisms underlying abiotic stresses tolerance. We found a new family of dehydrin proteins(CIP) in Ammopiptanthus mongolicus,which contains 130 members.We will systematically examine the functional diversification of the CIP gene family in Ammopiptanthus monogolicus by integrating phylogeny, expression,protein purification ,protein structure and transgene.We really hope we can screen desirable CIP gene members from the big family which can increase the abiotic stress tolerance of Arbidopsis thaliana by transgene technology.Based on the would-be successful research results,the CIP genes will be used in transgenetic breeding for abiotic stress tolerant improvement of woody plants,crop plants and ornamental palnts.

沙冬青是我国北方荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木，具有很强的抗逆性， 能忍耐极端低温和长期干旱，是非常重要的基因资源和观赏植物。沙冬青作为第三纪古地中海沿岸植物, 在气候旱化过程中, 能在环境残酷的现代分布区繁衍幸存至今，从进化角度来讲,一定形成了适应特殊生境的内在机制，逐步演化成现在能抵御高温、干旱、寒冷等多种非生物逆境胁迫的适应性特征。本研究在克隆获得沙冬青脱水素CIP 基因家族130个成员的基础上，分析该家族的系统发育、基因表达模式、基因表达蛋白的功能、以及蛋白质晶体三维结构数据，以期在不同层次上系统性地揭示该基因家族在长期的地质历史时期的功能分化模式及其分化机制，进而导致基因家族的形成，揭示该植物特殊抗逆机制形成的分子进化机制。在前述研究的基础上，筛选获得高效、抗逆功能不同的CIP 基因家族成员，转化模式植物拟南芥，为进一步利用基因工程技术培育林木、花卉及作物新品种奠定基础。

根据AmCIP序列设计引物，从低温、干旱、盐、高温胁迫处理的沙冬青中扩增得到126个与AmCIP同源性很高的脱水素基因。它们编码的蛋白为106至290个氨基酸残基。我们称这个家族为沙冬青KS型类脱水素家族。这些蛋白内部亲缘关系很近，与4种低温响应的脱水素亲缘关系最近，包括鬼箭锦鸡儿（Caragana jubata）AEJ20970.1，棘豆（Oxytropis campestris subsp. johannensis）AEV59620.1和AEV59619.1，以及棘豆（Oxytropis arctobia）AEV59613.1。通过CD-HIT软件聚类分析，筛选得到9个家族成员，命名为AmDHNs。结合Vitis vinifera (Vv)、Medicago truncatula (Mt)、Lotus japonicas (Lj)、Glycine max (Gm)的基因组数据和30个物种的脱水素基因数据，系统发育分析揭示了AmDHNs存在于沙冬青和蒺藜苜蓿共同的祖先中，并在沙冬青中发生了扩张；同时序列突变、蛋白二级结构和三维结构分析，暗示了K-和θ-motif是脱水素基因进化的主要贡献者，K-和θ-motif的中间部分，对抗逆性进化可能起主要的作用，这可能是由于与邻近的区域相比，该区域存在高比率的复制和DNA置换。从脱水素基因家族中挑选出7个基因AmP110C、AmP132E、AmP180D、AmP200O、AmP154E、AmP200Q、AmP95进行功能研究。转大肠杆菌实验表明，7个同源基因耐盐性较差，基因间耐盐规律不明显。菌体和LDH冻融实验表明，AmCIP的7个同源基因抗冻能力很强，基因之间的规律是：基因重复片段越少，对应的菌株和蛋白抗冻能力越强。菌体和LDH冻融结果的区别点在于FI及LV型蛋白抗冻效果不同，这些现象反映了基因家族重复基因会引起功能差异，从而利于生物体很好地适应环境变化。构建pCAMBIA2300-GFP载体，转化拟南芥，获得纯合体。干旱、盐胁迫下测定显示转基因植株较野生型有较强的抗逆性，且各基因之间功能也有差异。本研究还初步挖掘了沙冬青与干旱胁迫相关的miRNA，高通量测序获得了正常生长和干旱处理沙冬青原始数据三千四百万reads。sRNA的长度分析表明20、21、24 nt的表达丰度占主要部分。