BMSCs与EPCs联合构建血管化组织工程骨的机制研究

本课题拟构建携带eGFP荧光基因的新型慢病毒载体，转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）；构建携带RFP荧光基因的新型慢病毒载体, 转染内皮祖细胞（EPCs）。将获取的BMSCs-eGFP诱导为成骨细胞（IOB-eGFP）。将（BMSCs-eGFP）+（EPCs-RFP）以不同的组合比例植入生物材料，同比例梯度将（IOB-eGFP）+（EPCs-RFP）组合植入生物材料。采用显微外科技术制备大鼠股骨大段骨缺损，将上述复合有不同种类和种子细胞的生物材料植入修复骨缺损。通过双荧光基因的长期稳定体内示踪，观察两类荧光细胞的生长、迁移、分化和相互作用等。在此过程中，利用影像学、组织学、分子生物学和荧光活体成像等多种方法，客观分析和研究组织工程骨中成骨与成血管的动态变化并检测相关量性指标，以获得种子细胞联合构建血管化组织工程骨的最佳配比量效方案，同时探讨血管化组织工程骨中新生组织的来源和种子细胞的转归。

骨组织工程的研究具有广阔的临床应用和产业化开发前景。然而，长期以来，对于组织工程骨及其相关组织的体内构建过程和机制缺乏客观深入的了解，严重制约着骨组织工程在临床骨缺损尤其是大段负重骨缺损修复方面的应用。本课题采用红、绿荧光基因分别标记骨髓间充质干细胞（BMSC）及其来源的成骨细胞（OB）和内皮祖细胞（EPC）作为种子细胞，利用显微外科技术原位构建组织工程骨，探讨组织工程骨修复大段骨缺损时种子细胞的作用及其与宿主间的关系。本研究分别构建携带eGFP和RFP荧光标记基因的新型慢病毒载体，转染BMSC，获得BMSC-eGFP和BMSC-RFP，再经成骨诱导或成血管诱导，分别获得稳定表达不同荧光的成骨细胞（IOB）和内皮祖细胞/内皮细胞（EPC/IEC）；两种荧光基因均可长期稳定表达并遗传给子代细胞。将IOB-eGFP和EPC/IEC-RFP细胞以不同比例植入生物支架材料，同时采用显微外科技术制备股骨大段骨缺损，再将复合了不同种子细胞的生物材料分别植入骨缺损局部进行原位修复，探讨不同种子细胞促进骨修复的机制。本课题以红、绿荧光蛋白转基因小鼠为模型，制备股骨大段骨缺损，将生物材料（复合了不同荧光基因标记的种子细胞后）植入骨缺损局部，原位修复骨缺损。在不同时间点，利用稳定表达的eGFP和RFP荧光在体内示踪靶细胞，以影像学、组织学、分子生物学和荧光定量PCR等多种方法，分析比较组织工程骨局部携带不同荧光的种子细胞的生长、迁移、分化及其相互作用等。本研究初步分析了工程骨原位构建的不同种子细胞配比与成骨的量效关系，并初步探讨种子细胞和宿主细胞在新生组织工程骨成骨中的作用机制。