阿帕替尼通过抑制PLCγ通路调节肝癌放疗敏感性的机制研究

We have published a series of papers on the blockade of VEGF/VEGFR2 autocrine signaling pathway and the inhibition of PLCγ-pAkt-mediated cell survival by Apatinib. According to the literature, the activation of VEGR/VEGFR2 induces radio-resistance through PLCγ-dependent activation of endoplasmic reticulum stress (ERS). In our preliminary study, we demonstrated the enhancement of radiation-induced cytotoxicity on hepatocellular carcinoma (HCC) cells by Apatinib via cell growth and clonogenicity inhibition, the induction of cell apoptosis and cell cycle arrest at G2/M phase, and the delay of DNA double strand break (DSB) repaired. Thus, we propose that Apatinib modulates radiosensivity of HCC through the activation of ERS. This study aims to monitor the dynamic changes on the expression of critical mediators in the ERS signaling pathway to prove that the suppression of ERS is one of the important mechanisms underlying the enhancement of radiosensitivity in HCC by Apatinib. Furthermore, we use gene silencing technology or PLCγ activator/inhibitor to investigate whether the suppression of ERS is through PLCγ-dependent pathway. This study aims to clarify the mechanism of the modulation of radiosensitivity on HCC by Apatinib and provide theoretical basis on the individualized combination treatment with both Apatinib and radiation therapy on HCC.

本课题组已发表系列文章报道阿帕替尼阻断VEGF/VEGFR2自分泌通路并抑制PLCγ-pAkt介导的细胞存活。文献报道，VEGF与VEGFR2结合可通过激活PLCγ依赖的内质网应激（ERS）通路介导细胞对放疗抵抗。预实验结果显示，阿帕替尼在以下方面：细胞生长和克隆形成抑制、诱导凋亡及细胞周期停滞于G2/M期、延缓肝癌细胞DNA双链断裂修复增强放疗对肝癌细胞的杀伤作用。由此我们推测，阿帕替尼对肝癌的放疗增敏很可能是通过抑制PLCγ依赖的ERS而实现的。本项目拟通过检测阿帕替尼联合放疗处理后肝癌细胞中ERS通路关键分子的动态变化证实抑制ERS是阿帕替尼增敏放疗的重要机制；并通过基因沉默或PLCγ激动/拮抗剂，研究阿帕替尼抑制ERS是否通过PLCγ通路介导。本项目旨在阐明阿帕替尼调节肝癌放疗敏感性的机制，为阿帕替尼联合放疗个体化应用于肝癌治疗提供理论基础。

背景：我国是肝癌大国。长期以来，局部治疗是肝癌的主要根治性治疗手段，而抗血管生成药物是肝癌内科治疗中的主要基石用药。随着放疗技术的进步，立体定向放疗在肝癌中的应用越来越受到重视。影响肿瘤放疗敏感性的其中一个因素是实体瘤内部存在大量乏氧细胞，乏氧不仅因失去氧对放射性损伤的“固定”效应而削弱了放射线的杀伤作用，电离辐射本身被报道能够通过促进肿瘤组织 VEGF 的生成和 VEGFR2 磷酸化诱导新生血管形成而促进肿瘤的侵袭和转移。阿帕替尼是选择性VEGFR2抑制剂，本课题的主要目的是研究阿帕替尼在肝癌放射治疗中是否具备增敏作用。.方法：处理肝癌细胞系SMMC-7721, MHCC-97H, HCCLM3以及 Hep-3B分别给与以下处理：阿帕替尼单药、电离辐射以及阿帕替尼联合电离辐射。我们采用克隆形成实验、流式细胞进行细胞周期分析和凋亡检测、以及免疫荧光染色计算细胞核内γ-H2AX焦点数等方法评估联合治疗对杀伤肝癌细胞的有效性。我们对治疗前后的细胞进行RNA测序以探讨联合治疗相互协同的潜在机制。最后，我们在小鼠移植瘤模型中验证体外实验发现的联合治疗效果。.结果：克隆形成实验发现阿帕替尼能够增加HCC细胞系对电离辐射的敏感性。阿帕替尼能够抑制电离辐射导致的肝癌细胞DNA双链断裂修复。流式细胞检测结果显示阿帕替尼能够增加电离辐射诱导的细胞凋亡。RNA测序并通路分析发现电离辐射所诱导的PI3K/AKT通路活化被阿帕替尼所抑制，可能成为阿帕替尼增敏放疗的机制之一。此外，动物实验证实阿帕替尼联合电离辐射能够显著压制小鼠移植瘤的生长。.结论：阿帕替尼通过抑制肝癌放疗诱导的PI3K/AKT通路激活实现增敏作用，可以作为肝癌放疗的增敏剂。.科学意义：该项目的完成将为深入阐明阿帕替尼调控肝癌细胞对放疗敏感性的分子机 理提供实验研究的依据，为阿帕替尼联合放疗在肝癌中的临床应用和个体化选择提供理论依据。