人参皂苷Rg1调节钙敏感受体影响异基因脐带血造血干细胞移植效果的机制探讨

Allogeneic cord blood-hematopoietic stem cell transplantation （CB-HSCT） was more and more widely used to treat many diseases such as leukemia and so on. But there are some key factors restricting the development of therapeutic technological, for instance, fewer hematopoietic stem cell numbers, engraftment delay, no better recovery of neutrophile granulocyte and platelet and graft-versus-host disease. Recently, Our research results show that ginsenosides Rg1 may recover hematopoietic function in bone marrow depression mice induced by cyclophosphamide, and improve the therapeutic effects of CB-mononuclear cell transplantation in radioactivity bone marrow injuried mice. Neutrophile granulocyte and platelet were early increased. The mechanisms are involved in hematopoietic stem cell proliferation, microenvironment improvement and calcium sensing receptor (CaR) regulation. Therefore, The project will overall and penetrate deeply explor the effects and mechanisms of Rg1 on hematopoietic and immunological reconstitution, GVHD risk, HSCs homeing and engraftment and kinetics of cell generation cycle in marrow stroma cells by CaR regulation. Experimental technologies include some of classical and advanced as immunomagnetic beads sorting, fluorescent labeling, protein blotting, flow cytometry and small animal imaging in vovo, and so on. The accomplish of these aims will identify the mechanism of CaR activity regulation, and find a new agent for improving myeloablative allogeneic CB-HSCT effects. Then promote allogeneic CB-HSCT technology implemented generalization.

异基因脐带血造血干细胞移植（CB-HSCT）已经越来越多地用于白血病等多种疾病治疗，但造血干细胞数量少，移植物植入延迟，中性粒细胞和血小板恢复较差，以及移植物抗宿主病（GVHD）等，一直是制约该技术发展的关键。我们近年的研究发现，人参皂苷Rg1可恢复环磷酰胺诱导的骨髓抑制者造血功能，提高放射性骨髓损伤小鼠CB单个核细胞移植治疗效果，较早提高中性粒细胞和血小板水平，机制涉及促进HSCs增殖、改善微环境，调节钙敏感受体（CaR）。因此，本项目拟就Rg1调节CaR影响清髓异基因CB-HSCT治疗后造血、免疫重建、GVHD发生、HSCs归巢、植活和骨髓基质细胞增殖周期动力学等进行全面深入地探讨，分析其分子机制，实验技术涉及免疫磁珠分选、荧光标记、蛋白印迹、流式细胞术、小动物活体成像等经典与先进实验技术。项目的完成将明确CaR的活性调节机制，并发现提高异基因HSCT疗效的新药，促进该技术应用的推广。

按照合同书计划和要求完成了五个方面的研究内容，调整离体实验首先完成，检测分析了人参皂苷Rg1对人脐带血造血干细胞（CB-HSCs）迁移、粘附及向粒系和巨核细胞系分化的影响及其机制，并阐述了Rg1对白消胺（Bu）和环磷酰胺（Cy）损伤小鼠骨髓基质细胞增殖动力学的影响；在体实验采用Bu-Cy方案清髓预处理，研究了人参皂苷Rg1对脐带血HSCs移植小鼠造血的、免疫的功能及移植物抗宿主病（GVHD）的影响；并以钙敏感受体（CaR）为靶点，采用经典和先进的免疫磁珠分选、荧光标记示踪、小动物活体成像、悬液芯片检测技术、流式细胞分析术、定量PCR和蛋白印迹等方法，探讨了Rg1调节骨髓组织CaR的表达与活性变化、造血微环境的改变及其涉及ERK、P38及多种免疫分子变化的分子机制。取得主要进展和成果如下：（1）Rg1明显促进CB-HSCs迁移、粘附的作用与影响F-actin蛋白表达、解聚或重排有关，也涉及调节CaR、CXCR4、ERK和P38表达与活性；与CaR受体激动剂不同，Rg1具有促进脐带血HSCs增殖及向巨核系细胞分化、成熟的作用。（2）Rg1促进Bu+Cy损伤小鼠骨髓基质细胞增生的作用与调节Cyclin D1和P21cip1蛋白表达有关。（3）Rg1明显促进脐带血HSCs移植后的造血、免疫功能恢复，尤其是快速恢复粒细胞与血小板至正常水平，作用机制与调节CaR活性，促进HSCs归巢、增殖和分化，改善骨髓造血微环境，调节多种血细胞分化因子含量有关。（4）同时Rg1通过提高CD4/CD8 T细胞比值，上调Treg细胞比例，可明显减轻了异基因HSCs移植后的GVHD发生程度。这些结果表明，Rg1可能作为一种CaR活性的调节剂，显著地提高清髓预处理异基因脐带血HSCs移植治疗效果。也为进一步发现Rg1和CaR激动剂潜在的临床应用奠定了重要的理论基础。所建立的脐带血间充质干细胞培养新方法大大提高了间充质干细胞培养成功率, 也提供了联合脐带血间充质干细胞移植治疗的可能。