ZmNLP6与ZmNRG2.7互作调控玉米氮素利用的机制研究

The keys of improving the nitrogen utilization efficiency and high nitrogen efficiency breeding are studying the mechanisms of nitrogen utilization and analysing the nitrogen regulation network in maize. However, using the functional analysis of nitrate nitrogen regulatory genes as a starting point of research to discover the regulatory network is still limited. In our previous study, we have isolated two nitrate regulatory genes ZmNLP6 and ZmNRG2.7, which could be interacted with each other. The fluorescence results indicated that ZmNLP6 and ZmNRG2.7 functioned in the same pathway in regulating nitrate signal transduction. This project intends to validate the synergistic effect of ZmNLP6 and ZmNRG2.7 interaction in regulating nitrate signal through protein interaction analysis and nitrate induced response analysis. To study the physiological indices of nitrate metabolism and expression of key nitrate utilization genes for clarifying the function of protein interaction using single, double mutants and Arabidopsis thaliana transformed by double genes. ChIP-seq and yeast-one hybrid will be used to identify the nitrate metabolism pathway and downstream target genes regulated by ZmNLP6 and ZmNRG2.7. All these will help to discover the ZmNLP6 and ZmNRG2.7-mediated nitrate regulatory network, and provide new sights into improving nitrate utilization efficiency and high nitrogen efficiency breeding.

研究玉米的氮素利用规律与机制，解析氮素调控网络是提高玉米氮素利用效率和高氮效育种的关键。但玉米中仍缺少以研究硝态氮调控基因的功能为切入点，并揭示调控网络的研究。前期研究我们分离了玉米中两个具有硝态氮调控功能的基因ZmNLP6和ZmNRG2.7，并在体外验证了两蛋白存在相互作用；荧光结果显示ZmNLP6和ZmNRG2.7在调控硝态氮信号中处于同一通路。本项目拟通过体内蛋白互作分析和硝态氮诱导响应分析来验证ZmNLP6和ZmNRG2.7互作在调控硝态氮信号中的协同作用；研究玉米单、双突变体和拟南芥双基因转化株系中硝态氮代谢指标和利用关键基因表达来明确蛋白互作的功能；利用ChIP-seq和酵母单杂交技术鉴定ZmNLP6和ZmNRG2.7协同调控的硝态氮代谢通路及下游靶基因，从而揭示ZmNLP6和ZmNRG2.7为中心的硝态氮调控网络，为提高玉米氮素利用效率和高氮效育种提供新思路。

维持玉米高产稳产需要大量氮肥的投入，但是现阶段玉米的氮素利用效率低至30%左右，其重要原因是缺乏玉米高氮效育种的切入点。构建玉米氮素利用调控网络，揭示关键基因作用的调控机制是解决该问题的关键。前期我们利用遗传互补的方法鉴定到一个调控玉米硝态氮信号的成员ZmNLP6，并通过文库筛选的方法找到一个与其互作的蛋白ZmNRG2.7。本研究主要是探究了ZmNLP6与ZmNRG2.7在玉米硝态氮信号调控中的作用，尤其关注互作过程对于调控硝态氮利用的机制。主要结果如下：我们利用酵母双杂交、BiFC、Co-IP等技术确认了ZmNLP6与ZmNRG2.7的蛋白互作，为后续实验开展奠定基础；同时对玉米中的ZmNRG2成员在不同生育期、不同部位的表达和亚细胞定位分析，发现与ZmNLP6的模式重合，以上佐证了两者可能共同调控硝态氮利用。将ZmNLP6与ZmNRG2.7共同转化拟南芥发现，共表达两个基因比单一基因过表达对硝态氮响应基因的诱导、硝态氮含量和NR活性的强化更显著，证明两者能协同调控硝态氮利用；同时共转化植株在单株产量、千粒重和NUE方面都显著提高。对ZmNLP6与ZmNRG2.7的玉米等位无义突变体和过表达转基因材料分析发现，突变体中硝态氮诱导基因表达、硝态氮含量和NR活性显著下降，证明ZmNLP6与ZmNRG2.7确实参与调控硝态氮信号并影响吸收和同化过程。ZmNLP6与ZmNRG2.7的单、双突变体在高、低氮条件下都表现出株高降低、生物量减少的表型；同时果穗的穗轴长、穗行数和行粒数减少，最终导致单株籽粒减少。我们分离到了ZmNLP6与ZmNRG2.7调控的硝态氮利用的靶基因ZmNRT3.1A、ZmNiR等，发现ZmNLP6在体内和体外都能结合靶基因的启动子，但是ZmNRG2.7只能在体内结合，说明ZmNRG2.7对于靶基因的结合需要ZmNLP6的互作参与。ZmNLP6能够结合并以转录激活的方式调控ZmNRT3.1A、ZmNiR的表达；当ZmNRG2.7与ZmNLP6互作后，复合体对于靶基因的转录激活能力增强，并最终使玉米强化硝态氮吸收和同化过程，并提高玉米的氮素利用效率。本研究提出了一种在玉米硝态氮利用中以蛋白互作为前提的转录调控方式作用模式，丰富了玉米氮素调控方式与网络，也为高氮效育种提供了新的思路。