涡虫补体C3的进化和功能及其激活途径的研究

补体是无脊椎动物先天性免疫的重要组成部分，并在先天性免疫和获得性免疫间起重要联系作用。虽然补体的研究历史较久，但补体最早出现于哪类动物及其激活途径的进化目前仍不清楚。本课题拟从检测在进化上占据重要地位的涡虫中是否存在补体C3蛋白（补体系统的中心成分）入手，通过克隆涡虫补体C3基因和系统演化分析研究其进化规律；通过免疫组化和原位杂交研究其在不同组织的分布和不同发育时期的时空表达探索补体C3的功能；通过补体抑制、激活剂诱导前后和RNA干扰前后涡虫补体关键蛋白含量和关键基因表达量变化研究其通过何种激活途径起作用。最后结合进化生物学与免疫学知识，阐明涡虫补体C3的进化和功能及其参与的激活途径。本课题将对补体系统的起源与进化和先天性免疫分子的进化与功能研究具有重要意义，甚至为探索脊椎动物获得性免疫系统的起源提供佐证。

补体是无脊椎动物先天性免疫的重要组成部分，并在先天性免疫和获得性免疫间起重要联系作用。虽然补体的研究历史较久，但补体最早出现于哪类动物及其激活途径的进化目前仍不清楚。本课题进行了以下研究：.（1）涡虫(类)补体C3蛋白的检出、定位和定量。用Western blot、免疫组化和ELISA鉴定出涡虫（类）补体C3蛋白确实存在，且主要分布在表皮和咽上皮；涡虫体液中（类）补体C3的浓度约是0.65 mg/ml。.（2）涡虫（类）补体C3基因的克隆与演化。利用PCR和RACE扩增出涡虫（类）补体C3基因DjA2M的全长5804 bp，最大开放阅读框5574 bp，编码1857 aa。包含诱饵区，内部硫酯键和受体结合区三个保守功能域。利用Philips tree soft软件构建进化树分析发现涡虫DjA2M属于A2M亚科，在进化树中涡虫DjA2M基因位于原口动物基部，与涡虫的进化地位相符。.（3）涡虫体内（类）补体C3的功能。利用整体原位杂交技术发现DjA2M基因在涡虫体内表达于咽部。说明DjA2M在涡虫中可能参与了免疫应答。.（4）涡虫类补体C3参与的补体激活途。加入特异性C4（补体经典途径和凝集素途径的关键蛋白）抗体后对涡虫体液的杀菌效果影响不大；但加入Bf（替代途径的关键蛋白）抗体后，对涡虫体液的杀菌效果影响显著。加入酵母聚糖和肼后，涡虫体液对抑菌活性和溶血活性均显著下降。加入EDTA后涡虫体液的杀菌活性显著变化，而且可通过加入等量Mg2+恢复其杀菌活性，但加入等量Ca2+却不能恢复其活性；而加入EGTA后，对涡虫体液的杀菌活性无显著影响。这些结果说明涡虫体液补体系统的杀菌活性主要是通过替代途径实现的。通过western blot和免疫组化实验也证明替代途径关键因子类Bf确实存在，主要分布在涡虫的表皮、咽和肠上。LPS诱导涡虫后，类补体C3和类Bf蛋白和基因的表达量都明显增加，说明涡虫体内补体系统确实是通过替代途径起作用。RNA干扰后，随着dsRNA浓度的增大，涡虫溶血活性明显降低。这说明类补体C3蛋白DjA2M参与了涡虫补体替代途径的作用。. 本课题将对补体系统的起源与进化和先天性免疫分子的进化与功能研究具有重要意义，甚至为探索脊椎动物获得性免疫系统的起源提供佐证。