PpADC基因调控桃树抗逆性的分子机制研究

Our previous work showed that PpADC was obviously induced by drought, low temperature and salt stresses, suggesting that PpADC was responsive to various stresses. The promoter of PpADC was isolated and bioinformatics analysis indicated that it contained the putative cis-elements related to drought, low temperature and so on. Based on the obtained data, this project first compares the differences of the phenotype between the transgenic lines and WT, and then related physiological indexes will be measured, including electrolyte leakage and chlorophyll content. Promoter deletions will be conducted and the corresponding vectors will be transferred into Micro-Tom tomato. GUS staining and fluorescent quantification will be used to identify the function of the promoter in response to stresses. Cis-elements on the promoter will be analyzed via electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and site-directed mutagenesis. Then the corresponding transcription factors binding to the cis-element will be selected by yeast one-hybrid. In addition, subcellular localization and transcriptional changes responsive to stresses will be analyzed. This project is based on previously obtained data, it will have in-depth analysis on characterization of the function of PpADC and provide candidate gene for genetic improvement of peach.

前期研究表明基因PpADC（桃树精氨酸脱羧酶）是一个多重胁迫应答基因，其转录表达明显受到干旱、低温和高盐等胁迫诱导。分离PpADC启动子进行生物信息学分析表明，PpADC启动子上含有干旱、低温等逆境应答顺式作用元件。在此基础上，本项目首先比较逆境处理下的植株表型，测定相关生理指标，以验证PpADC的抗逆功能。构建启动子不同类型的缺失载体转化Micro-Tom番茄，借助GUS染色和荧光定量技术，鉴定启动子的逆境调控功能，通过凝胶阻滞和定点突变分析确定启动子上逆境应答顺式作用元件，酵母单杂交筛选与逆境顺式作用元件特异结合的转录因子，结合转录因子的亚细胞定位及其编码基因的逆境转录表达模式，解析基因PpADC调控桃树抗逆性的分子机制。本项目是已有研究的深入和延续，既为揭示PpADC应答逆境的转录调控机制奠定基础，又为桃树抗逆遗传改良工程发掘优良基因资源，具有重要理论意义和潜在应用价值。

发掘基因的逆境生物学功能和解析基因的转录调控机制是阐明目标基因在桃树应答逆境胁迫过程中发挥生物学作用的必要手段和途径，多胺广泛参与植物应答逆境胁迫，精氨酸脱羧酶基因（ADC）是植物体内合成多胺的关键基因。本项目以桃树为试验材料，桃树精氨酸脱羧酶编码基因（PpADC）为研究对象，通过将基因PpADC超量表达载体异源转化番茄，研究基因PpADC在逆境胁迫条件下的生物学功能，同时通过构建桃树干旱cDNA文库和基因PpADC启动子Bait菌株，酵母单杂交筛选与基因PpADC启动子序列互作的转录调控因子，从而揭示基因PpADC在桃树应答干旱胁迫过程中的转录调控机制。项目自获得资助以来，取得了一些研究进展：（1）通过分析基因PpADC在干旱胁迫条件下的转录表达模式，构建了桃树干旱PGADT7均一化cDNA文库，平均长度大于1 kb，重组率约100%，冗余率约0%；（2）对基因PpADC启动子序列进行生物信息学分析，获得MYB（CTGTTG）、MYC（CACCTG)、DRE1（ACCGAGA）、ABRE（CACGCGG）和ABRE（AACGCGG）五个干旱逆境胁迫相关的候选顺式元件及其位点，构建了包含MYB、MYC和DRE1顺式元件的PpADC启动子Bait 5菌株；（3）以桃树干旱pGADT7均一化cDNA文库与PpADC启动子Bait 5菌株进行单杂交筛选，获得了BES1/BZR1（LOC18771365）、CIPK激酶（LOC18788706）、F-box（LOC18767171）、KAN1（LOC18777573）、PERK1（LOC18771393）、HIPP（LOC18768217）和bHLH1 （LOC18768884）等多个涉及非生物逆境胁迫转录因子。本项目发掘了基因PpADC在逆境胁迫过程中的部分生物学功能，初步解析了基因PpADC应答干旱逆境的转录调控机制，为桃树进行抗逆遗传改良工程发掘了候选基因资源，具有一定的理论意义和潜在应用价值。