高灵敏度磁平台多波长电化学发光多种致病菌基因快速同步检测新技术研发

Pathogen detection is the key to the early warning and discovery of emergent acute infectious diseases, epidemic monitoring, and rational use of antibiotics. Current detection technologies mostly can only detect one pathogen in one experiment and cannot satisfy the needs of the current complex and serious epidemic prevention and control situations. To address this reality, the applicant, based on the previous project, first proposes a technology for rapid simultaneous detection of multiple pathogenic genes. This technology features high sensitivity, magnetic platform, multi wavelength, and electrochemiluminescence. It: 1. Uses efficient magnetic enrichment target bacteria to replace the traditional bacteria culture process, thus simplifying the operational steps, reducing the detection time, and achieving automated operation. 2. Designs and synthesizes electrochemiluminescent markers with different emission wavelengths so as to prepare pathogenic nucleic acid signal probes with different wavelengths that can identify and mark different target genes of pathogenic bacteria. 3. Uses stable-performance and easy-to-preserve dendrimers and other nano-materials as the signal amplification carrier to amplify the order of magnitude of the detection signals. Meanwhile, the technology also explores the direct detection of target genes without PCR amplification. 4. Builds a multi-wavelength electrochemiluminescence detection platform for simultaneous collection and reading of optical signals with different wavelengths. Finally, a highly efficient, sensitive, accurate, and practical new technology for rapid simultaneous detection of multiple pathogenic genes is created.

致病菌检测已成为当前突发急性传染病预警和早期发现、疫情监测、合理使用抗生素等工作的关键。现有的检测技术大多一次实验只能检测一种致病菌，不能满足当前复杂严峻的疫情防治形势需要。针对此现实，申请人在前期项目基础上，首次提出开发高灵敏度磁平台多波长电化学发光多种致病菌基因快速同步检测新技术。1、采用高效磁富集目标菌取代传统的培养增菌过程，从而简化操作步骤、缩短检测时间、实现自动化操作。2、设计与合成具有不同发射波长的电化学发光核酸信号探针，用于识别与标记不同的致病菌特征基因。3、采用性能稳定、易于保存的树状分子等纳米材料作为信号放大的载体，对检测信号进行数量级的放大，进而建立非PCR扩增直接检测目标菌基因的方法。4、构建多波长电化学发光检测平台，实现对不同波长光信号的同步采集和读取。最终建立一种高效、灵敏、准确、实用的多种致病菌基因快速同步检测新技术。

核酸检测是一种相比免疫分析更加灵敏度和准确的检测方法，核酸检测已经越来越多的应用到疾病诊断，食品安全、环境监测等领域当中。本项目拟开展更灵敏、更快速的致病菌基因检测方法和仪器的研究，希望为病原微生物检测提供新的技术解决方案。首先，本项目研究了一种基于电化学发光技术的核酸检测方法，通过研究电化学发光反应池设计，数据采集及信号处理等，完成了一套可以实现电化学发光检测的系统。通过设计通用的电化学发光信号放大探针，实现了高灵敏度、高特异性的特征基因检测。随后，又设计了分支DNA 信号放大电化学发光基因检测体系，进一步提高了检测效率。此外，基于近来发现的新型CRISPR系统，本项目开发了一些具有优势性能的基因检测新方法，其中包括① 基于CRISPR/Cas9的高特异性切割性能，实现在闭管的PCR体系和逆转录PCR体系中对气溶胶污染核酸产物的特异性切割，解决了PCR终点检测法的污染难题；②开发了基于CRISPR/Cas9作为靶向探针、以金纳米颗粒作为显色探针的基因试纸条，实现肉眼可视化的基因检测。并进一步设计了一种双基因同时检测的试纸策略，提高了检测的精确性；③ 基于CRISPR-Cas12a系统对DNA识别后激活的高效的反式酶切割活性，并结合了一种微液滴的超局域检测体系，实现了免核酸扩增的单个DNA分子的检测。该技术可以对DNA分子进行数字化绝对定量，是一种具有变革性潜力的新技术。总的来说，通过本项目的研究，开发了一些具有强应用性的基因检测新技术，有望为后续的基因快检测检测应用提供可选择的方案。