基于次级代谢产物活性和结构的重楼内生菌多样性及与宿主植物相关性研究

Paris are very important traditional medicinal plants which are used in traditional Chinese medicines, such as Yunnan Baiyao, Jidesheng Sheyao Tablets and Gongxuening Capsule. With the development of pharmaceutical industry, the demand of Paris Rhizome grows sharply. Due to long growth cycle of the medicinal parts of Paris, and the narrow distribution range of wild resources, coupled with local farmers’ indiscriminate digging, available resources of Paris are almost depletion. Now, Paris has been listed as one of 30 kinds of endangered natural medicinal plants in Yunnan Province. Therefore, looking for alternative sources of Paris is very necessary. Studies have demonstrated that: steroidal saponins, the main chemical components of Paris, are active ingredients for strong hemostasis effects. In this study, based on the clinical application of Paris on hemostatic effects（platelet affregation activity）, fermentation extracts of endophytes will be screened to determine the strains that can produce steroidal saponins. Using culture dependent and independent methods to investigate the species diversity, community composition and ecological distribution of endophytes, combined with analyzing the diversity of secondary metabolisms, will benefit the study on correlations of the endophytes with their host，and help to solve the Paris resource depletion problem, provide foundation of alternative resources for Paris.

重楼是一味重要的传统中药，是著名中成药云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁胶囊的重要组成药味。随着制药工业逐年增加的需求量，重楼的需求急剧增加。而重楼的药用部位生长周期长，且野生资源分布范围较窄，加之药农滥采乱挖严重，现在可采量面临枯竭，已列为云南省30 种稀缺濒危天然药物之一。因此，寻找重楼的替代资源具有十分重要的意义。对重楼的药理活性研究表明：甾体皂苷类化合物是重楼中的主要化学成分，也为重楼中的主要活性成分，具有很强的止血作用。本课题以重楼内生菌发酵培养产物为研究对象，基于重楼的主要临床应用——止血活性（诱导血小板凝集活性）筛选，寻找能够产生甾体皂苷类活性物质的重楼内生菌。利用纯培养和免培养方法，探讨重楼内生细菌的物种多样性及其分布规律，结合活性菌株的产物结构多样性，研究重楼内生菌活性次级代谢产物与其宿主植物活性的相关性，为解决重楼资源枯竭，进行重楼替代资源的开发利用提供理论依据。

由于传统应用的有效性和现代药理研究证明重楼具有多样的生物活性及独特的药用价值，其用量巨大，但资源匮乏，人工种植困难，现已列为云南省30 种稀缺濒危天然药物之一。目前国内外对于重楼药用植物内生菌的多样性、群落组成、诱导血小板的凝集活性等方面鲜有报道，缺乏系统性研究。.利用Miseq高通量测序研究发现了253个可操作分类单位，分属于9个门，15个纲，29个目，46个科，72个属，显示出重楼内生菌较高的物种多样性。分析结果显示重楼内生菌在不同宿主内和不同植物组织部位的群落组成都存在差异。.本研究从云南、贵州和福建采集了30株重楼药用植物，开展了内生菌种质资源的分离、培养、鉴定和保藏工作，得到800株内生菌。基于16S rRNA基因序列的比对结果显示内生细菌分属于放线菌门、变形菌门和厚壁菌门的12个目30个科56个属；优势种包括链霉菌属（Streptomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、小单孢子菌属（Micromonospora）。与近源菌株的相似性≤98.2%的有20株，至少包括7个潜在新分类单元。完成菌株CPCC 203535和CPCCC 204357、CPCC 204355、CPCC 204354的新物种分类工作。.将800株重楼内生菌分别用两种培养基发酵、抽提获得1600个发酵液粗提品。对其中600个发酵液粗提品进行诱导血小板的凝集活性初筛，并对89个初筛阳性样品进行了复筛，得到47个复筛阳性菌株。将12株阳性细菌和11株阳性放线菌的发酵产物通过UPLC-MS在线分析，活性细菌菌株的发酵液中未发现有重楼皂苷或其类似物存在，而在放线菌443和451菌发酵产物中发现可能存在类甾体皂苷成分。选择443的发酵液进行分离提取，确定甾体皂苷目标产物存在于菌丝提取物的正丁醇部位，分子量为896，初步实验结果表明部分重楼内生菌能够产生与宿主相同或相似的促进血小板聚集效应活性的物质。然而，另一些活性产物中并未发现重楼皂苷或其类似物存在，提示这些重楼内生菌可能代谢不同于重楼皂苷且具有血小板聚集效应的活性成分，这为开发利用重楼内生菌资源，筛选创新型微生物来源药物奠定了基础。