雌根结线虫调控其寄主巨型细胞空泡化信号转导机制研究

本研究在分子植物病理学和信号转导理论的指导下，利用蛋白质组学和生物信息学技术，研究雌根结线虫调控其寄主巨型细胞空泡化的信号转导机制。该科学问题，是上一个自然科学基金项目研究内容的延续，可望获得突破性进展，研究结果创新性强。主要内容如下： 1.明确亲和性互作体系中根结线虫雌虫在寄主体内死亡过程与其寄主巨型细胞消失过程的形态学相关性；其食道腺分泌物特点；其寄主巨型细胞DNA细胞凋亡特征。2.用SDS-PAGE，MS质谱法以及生物信息学技术鉴定雌根结线虫食道腺信号蛋白；构建与雌虫相关的寄主巨型细胞空泡组织的cＤＮＡ差减文库。3.利用酵母双杂交及其衍生技术，和GST融合pull down技术，筛选出与雌根结线虫食道腺信号蛋白互作的寄主巨型细胞内的信号成分（蛋白质或DNA）。4.用基因沉默，荧光免疫杂交以及原位杂交等技术研究这些信号组分功能及信号通路，实现目标。

本研究在分子植物病理学和信号转导理论的指导下，首次研究雌根结线虫调控其寄主巨型细胞空泡化的信号转导机制，获得突破性进展，取得了系列创新结果，实现了项目目标。.主要研究内容和重要结果如下：.1.明确亲和性互作体系中雌根结线虫在寄主体内死亡过程与其寄主巨型细胞消失过程的形态学相关性。利用所建立的亲和性互作体系，发现雌根结线虫在衰老过程中逐渐透明化；建立了番茄根结巨型细胞石蜡切片技术，进行病理切片后，发现其寄主巨型细胞TUNEL染色呈阳性，呈现出典型的植物细胞形态学凋亡特征。.2.用SDS-PAGE，双向电泳，MS质谱法以及生物信息学技术鉴定雌根结线虫食道腺信号蛋白 .2.1 利用上述技术，分离和鉴定出雌根结线虫食道腺蛋白的组分246个，其中17个蛋白与凋亡相关。2.2首次克隆出南方根结线虫中细胞程序性死亡基因MiPDCD6基因的全长序列为1428 bp，通过半定量RT-PCR证明MiPDCD6基因在二龄幼虫和雌成虫体内表达。.3.利用酵母双杂交技术， GST融合pull down技术，基因沉默技术和荧光免疫定位技术，筛选出与雌根结线虫食道腺信号蛋白互作的寄主巨型细胞内的信号成分蛋白，明确信号组分功能及信号通路，实现项目目标。.3.1 成功构建了番茄根组织酵母双杂交cDNA文库和MiPDCD6诱饵载体，筛选出了MiPDCD6与番茄根组织cDNA文库互作的MYB330蛋白。3.2 完成番茄根内LeMYB330的克隆和结构及功能分析。3.3 完成MiPDCD6蛋白和LeMYB330蛋白的原核表达和纯化。3.4 利用Pull-down技术，验证了LeMYB330和MiPDCD6融合蛋白的互作关系。3.5 建立寄主体内雌根结线虫基因沉默技术，发现MiPDCD6基因沉默后，寄主根结数变少。3.6建立了雌根结线虫食道腺蛋白原位杂交技术，证明MiPDCD6基因主要在根结线虫食道腺和肌肉层中表达；3.7利用荧光免疫定位技术，发现寄主巨型细胞内有雌根结线虫MiPDCD6蛋白。. 综合以上研究结果，可知根结线虫将MiPDCD6蛋白分泌到寄主巨型细胞内，和寄主的le MYB330蛋白相互作用，共同调控其寄主巨型细胞的空泡化过程。该结果未见报道。该研究首次揭示根结线虫可以调控其寄主巨型细胞的空泡化信号转导机理，具有重要科学意义。