中华按蚊主效抗性分子CYP4H14在菊酯杀虫剂抗性中的作用机制研究

Anopheles sinensis is one of the most important vectors of diseases in China. Severe insecticide resistance to the most widely used pesticide, deltamethrin, for the purpose of public health and agriculture, in Anopheles sinensis has been found through the vector surveillance. Previous study discovered that P450 enzymes activity enhancement played important role in insecticide resistance in Anopheles sinensis, furthermore, the specific high expression of CYP4H14 was confirmed in resistance-phenotype Anopheles sinensis from different regions by means of transcriptome and microarray expression profiling analysis. In addition, CYP4H14 exhibited the specific binding site to deltamethrin through the space molecular structural model. .Previous studies have shown that the deltamethrin resistance in mosquitoes often controlled by a very few “major functional genes”. Accordingly, in this study, we put forward the research hypothesis of “CYP4H14 genes in Anopheles sinensis may play an important role in the occurrence and development of deltamethrin resistance ”. To verify this hypothesis, the in vitro metabolic functional analysis of deltamethrin will be performed by the cloning and confirming of CYP4H14 and its receptor, followed by recombinant protein expression, then, the gene expression inducing of CYP4H14 by exposure to insecticide will be checked in deltamethrin-susceptible population, and the mosquitoes mortality by exposure to deltamethrin checked in deltamethrin-resistant population after the CYP4H14 gene silence, respectively, to further analyze the in vivo functional role. Overall, this study would provide an important scientific basis for insecticide resistance monitoring, and the development of new insecticide formulations.

中华按蚊是我国最重要的传病媒介之一，监测发现其对公共卫生和农业上最常用的溴氰菊酯杀虫剂产生高度抗性，课题组前期发现P450酶活性的增高在中华按蚊溴氰菊酯抗性产生中发挥重要作用，进一步经转录组、芯片表达谱分析等方法验证其中CYP4H14在不同地区菊酯杀虫剂抗性中华按蚊中呈现稳定的特异性高表达；空间构象模型预测还发现CYP4H14具有与溴氰菊酯杀虫剂直接作用的特异性位点。因按蚊菊酯类杀虫剂抗性常由极少数“主效基因”控制，因此本项目提出“中华按蚊细胞色素CYP4H14可能作为中华按蚊溴氰菊酯杀虫剂抗性相关的主效分子，在抗性发生发展中发挥重要作用”的科研假说，拟通过对Cyp4h14基因及其受体的克隆鉴定和重组表达，进行溴氰菊酯杀虫剂代谢的体外功能分析；并分别通过敏感群体的诱导表达和抗性群体基因沉默的体内功能验证技术途径来验证该假说，从而为中华按蚊溴氰菊酯杀虫剂抗性监测以及新剂型杀虫剂研发提供依据。

中华按蚊是我国最重要的传病媒介之一，但监测发现其对常用的溴氰菊酯杀虫剂产生高度抗性，课题组在前期发现P450酶系活性的增高在中华按蚊溴氰菊酯抗性产生中发挥重要作用的基础上，筛选得到了包括CYP4H14在内的6个杀虫剂抗性相关分子。本项目首先在实验室改良并建立了CDC生物瓶法杀虫剂敏感性检测法，确定实验室中华按蚊溴氰菊酯非致死剂量，并成功用于检测现场中华按蚊的不同杀虫剂抗性程度；发现现场抗性中华按蚊体均存在kdr突变，但不同杀虫剂抗性水平地区的kdr基因突变未发现明显差异；不同CYP基因在按蚊不同发育时期呈现明显的表达差异，其中CYP4H14在I-IV龄幼虫期基因表达量均显著低于其他时期，在雌性成蚊体内基因表达量是四龄幼虫期的22.5倍；CYP基因表达呈现明显的组织富集性，CYP4H14基因在中肠内表达量最高，其在中肠内的表达量为脂肪体内的9.87倍，其他CYP基因则在马氏管、中肠和脂肪体等不同的组织器官内富集表达，呈现多样性；实验室敏感中华按蚊经过接触溴氰菊酯杀虫剂以后，大多CYP基因均出现一定程度的表达上调；其中CYP4H14基因随着接触剂量的增加表达水平逐渐增高；在接触时间上，CYP4H14基因表达水平随时间（5-60min）变化变现为先升高，再维持表达水平不变；项目组还利用核磁共振波谱法（NMR）成功构建了实验室和现场不同杀虫剂抗性表型中华按蚊分析化合物组分模型，挖掘不同按蚊的显著差异代谢化合物，发现主要差异显著化合物的出现和按蚊的解毒酶的代谢途径密切有关；另外，项目组正在开展6个相关CYP基因的可能基因调控机制以及“选择性清除”等相关的遗传进化分析，以进一步了解相关CYP的作用机制和相互作用方式，为更好的建立媒介杀虫剂抗性检测方法和及时开展相应的杀虫剂抗性治理提供理论参考和科学依据。