反因子核酸酶靶向编辑HER-2基因的分子影像学评价

Breast Cancer is one of the most common female malignant tumors. Gene therapy as a novel and effective therapeutic approach, paved an avene to the the clincal treatments of breast cancer without the severe adverse events. As HER-2 signaling pathway plays a vital role in the development of breast cancer. Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) is used to konck-out the HER-2 gene in this study. This grant application include:1.preparing and selecting the best HER-2 element, cloning and seleting the most efficient TALENs targeting HER-2 gene and preparing its adenoviral form；2. testing the effects in in vitro culture cancer cells and evaluating the in vivo effects on breast cancer of TALENs using florescent scanning, MRI, optical imaging in multi-modal imaging systems.

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，原癌基因HER-2的改变与乳腺癌发生发展密切相关。目前靶向肿瘤基因治疗及其在体多模态成像监测是分子影像学的研究热点。本项目拟采用已有前期工作在艾滋病基因治疗基础研究中使用的新型分子反因子核酸酶，特异性靶向剪辑HER-2基因，研究阻断其信号通路达到靶向治疗乳腺癌的目的。实验采用荧光显微镜、动物活体成像仪、MRI多模态成像监测反因子核酸酶剪切效率和对肿瘤的治疗作用。研究内容包括：1.研发高效剪辑HER-2基因的反因子核酸酶，经腺病毒包装，行离体及在体癌细胞抑制和杀伤实验；2.用多模态成像监测反因子核酸酶对HER-2的剪辑效率和对癌细胞的抑制、杀伤能力，与荧光显微镜、流式细胞仪和病理学等检查相对照，评价多模态成像对该技术的监测效果和反因子核酸酶技术用于治疗乳腺癌的可行性。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，原癌基因HER-2的改变与乳腺癌发生发展密切相关。目前靶向肿瘤基因治疗及其在体多模态成像监测是分子影像学的研究热点。本项目拟采用新型分子核酸酶，特异性靶向剪辑HER-2基因，在细胞水平和动物水平观察核酸酶的剪切效率和对乳腺癌的治疗作用。研究结果如下：1.构建了靶向编辑乳腺癌相关基因HER2的TALENs和CRISPR/Cas9核酸酶系列质粒。2. 建立TALENs和CRISPR/Cas9核酸酶的原核和真核系统评估体系。原核评估体系是基于蓝白斑筛选技术，当核酸酶靶向剪切目的基因后，重组菌落的颜色由蓝色变为白色，实现通过观察菌落颜色的改变评估核酸酶的靶效应和脱靶效应；真核体系是基于博来霉素抗性基因为报告基因的评估体系，当核酸酶靶向剪切目的基因后，细胞可恢复博来霉素抗性，在博来霉素抗生素筛选下保持存活，实现通过观察细胞的死亡和存活评估核酸酶的靶效应和脱靶效应。3. 构建了稳定表达CAS9蛋白的乳腺癌BT474细胞，并筛选了具有高效剪切HER2基因活性sgRNA的CRISPR/Cas9核酸酶。4. 构建了乳腺癌裸鼠模型，通过小动物超声成像观察了经CRISPR/Cas9核酸酶靶向编辑HER2基因的实验组较对照组成瘤时间晚，成瘤范围小。上述结果提示，核酸酶特异性靶向HER2基因组编辑技术可在细胞水平和动物水平抑制乳腺癌的发生发展，为乳腺癌的临床基因治疗及多模态成像监测乳腺癌的病程提供了一定的基础实验数据。