共培养体系中群体感应介导的微囊化益生菌抑制肠道病原菌生物膜形成的机制研究

The antibiotic resistance in the intestinal infectious diseases has gained widely attention. Some research has confirmed that the formation of bacteria biofilm was among the reasons caused the antibiotic resistance, which was regulated by bacterial quorum sensing system. To reduce antibiotic usage, the probiotic treatment is introduced as the adjuvant therapy in clinical usages. However, the underlying mechanism of depressing the biofilm formation by the probiotic remained unclear. Our previous studies showed that the microencapsulated probiotics has the advantages of high quorum sensing expression and in-situ release of signaling molecules. Combining the frontier research on QS system and our research, a probiotic microcapsule-pathogenic co-culture model was established in this project to illustrate the influence of probiotics on prevention of the biofilm formation at morphology-gene-proteomics-metobolism level, and to discuss the underlying mechanism. Moreover, this study offered new ideas for pathogenic BF and QS inhibition, possibility for drug-resistant bacteria biological control, and a new research platform for bacterial QS interactions research.

抗生素治疗肠道病原菌感染过程中容易诱发的细菌耐药性问题备受关注。研究证实，病原菌形成生物膜（Biofilm, BF）是产生耐药性的重要原因之一，且BF形成受群体感应(Quorum Sensing, QS)调控。为了减少抗生素使用而采取的益生菌制剂辅助治疗已经在临床广泛使用，但目前对益生菌抑制病原菌BF形成的机制认识较少。本项目结合细菌QS现象的前沿领域并基于申请人既往研究发现微囊化益生菌具备高表达QS系统、实现信号分子原位释放及不同菌株简单分离的优势，拟设计、建立微囊化益生菌-病原菌共培养模型，探讨微囊化益生菌对病原菌BF及QS系统的抑制规律，从形态-基因-蛋白质组学-代谢水平上整合性地明确益生菌抑制病原菌BF形成的分子机制。本研究为益生菌微胶囊开拓新的应用方向，为抑制病原菌QS效应及耐药菌生物防治拓展新的思路，为研究细菌间QS相互作用提供一种新思路和崭新的研究平台。

本项目利用共培养体系中，微囊化手段可以实现不同菌株简单分离的优势，尝试将微囊化益生菌（鼠李糖乳杆菌）与病原菌（大肠杆菌）共培养，建立微囊化鼠李糖乳杆菌-大肠杆菌共培养模型。结果表明，在鼠李糖乳杆菌与大肠杆菌初始接种密度比为1:1时，可以在不影响菌株生长的前提下实现共培养。首先，利用激光共聚焦扫描显微镜结合紫外吸收方法从生物膜的微观结构分析鼠李糖乳杆菌微胶囊对大肠杆菌生物膜的抑制作用。利用稀释涂平板法得到微囊化鼠李糖乳杆菌的亚抑菌浓度（MIC）为2.5×108 CFU/mL 微囊。其次，利用PCR分子检测手段证明鼠李糖乳杆菌群体感应相关基因表达上调而大肠杆菌相同基因发生下调。进一步利用Label-free蛋白质组学检测技术筛选得到共培养前后鼠李糖乳杆菌及大肠杆菌发生变化的差异蛋白。结果表明，鼠李糖乳杆菌抗胁迫相关蛋白表达上调，能量代谢、核酸代谢相关蛋白表达下调；相应的，大肠杆菌酸胁迫、能量代谢相关蛋白表达上调而与菌体毒力和生物膜形成相关蛋白表达下调，并在基因水平上进行了验证，结果与蛋白质组学结果基本吻合。最后，初步证明了微囊化鼠李糖乳杆菌与临床分离病原菌共培养的处理方式，会在不同程度上降低病原菌的耐药性。本研究首次建立了微囊化益生菌-病原菌共培养研究平台，为益生菌微胶囊临床应用开拓了新的应用方向，为抑制病原菌生物膜形成及耐药菌生物防治拓展了新的思路，为研究细菌间相互作用提供了一种新思路和崭新的研究平台。本项目共发表SCI论文1篇，申请专利1项，培养硕士研究生2名，在读硕士研究生1名。