应用iTRAQ定量蛋白组学方法分析乳腺癌新辅助化疗后相关蛋白质的变化

乳腺癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程，以往有关乳腺癌研究大多集中在单个或少数几个相关基因及其蛋白质产物上，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释腺癌发生发展的机理。本项目拟以乳腺癌患者和正常志愿者的血清、乳腺癌患者新辅助化疗前后的血清、癌组织以及癌旁组织为研究样本，应用蛋白质组学技术从整体水平上分析各样本之间的蛋白质表达差异，试图找出乳腺癌的早期诊断标记物，筛选出对新辅助化疗有效的预测指标，寻找与乳腺癌发生发展及预后相关的"关键"蛋白质；并分析出这些差异表达的蛋白可能涉及的信号通路，同时通过免疫沉淀技术来研究在乳腺癌细胞内与这些差异表达的"关键"蛋白的相互作用蛋白，进一步从体外研究该蛋白的生物学功能，试图揭示其在乳腺癌发生发展过程中的作用，阐述乳腺癌发生发展的机理，以便为乳腺癌的早期诊断以及靶向治疗等提供科学资料。

本项研究以BTG2(B细胞易位基因2)以及PFN1作为主要的研究目标，了解二者在调控乳腺癌生长、增殖、凋亡及侵袭迁移等生物学活性中发挥的作用。本课题首先在细胞学及组织学水平证实了BTG2，PFN1和miR-182等基因或蛋白在乳腺癌细胞和组织中的特异性表达，随之对BTG2，PFN1和miR-182等基因或蛋白的功能进行了深入的研究分析，证实了BTG2，PFN1和miR-182等基因或蛋白在乳腺癌中发挥了重要的作用，其主要研究结果如下：.(1).BTG2基因可能具有抑制乳腺癌细胞生长增殖、促进其凋亡作用，同时BTG2基因对乳腺癌的侵袭迁移能力也有一定抑制作用，同时对Cyclin D1、MMP-1/2、Caspase3等乳腺癌增殖相关蛋白有影响。.pcDNA3.1-BTG2组细胞增殖活力显著降低(p<0.05)；FCM结果显示，pcDNA3.1-BTG2组G1期细胞明显增多(p<0.05)，S期期细胞明显减少；细胞迁移实验结果显示pcDNA3.1-BTG2组细胞穿膜率显著降低(P<0.05)；Cyclin D1、MMP-1/2在pcDNA3.1-BTG2组中的表达显著低于空载体组和空白组(p<0.05)，Caspase3在pcDNA3.1-BTG2组中的表达显著高于空载体组和空白组(p<0.05)。.(2). miR-182可负性调节PFN1蛋白的表达，且miR-182在乳腺癌组织和细胞中表达均上调，并可在体外促进乳腺癌细胞增殖和侵袭的能力。.与癌旁组织相比，miR-182在癌组织和细胞系中的表达显著上升(p<0.01)。与对照组相比，在MDA-MB-231细胞中转染miR-182抑制剂48h后，细胞中miR-182的表达显著下降(p<0.01)。MTT结果证实在细胞中抑制miR-182后，细胞活力明显下降(p<0.05)。通过流式细胞仪分析发现抑制miR-182表达后，细胞的增殖指数明显下降(p<0.05)；细胞的凋亡显著增加(p<0.05)。同时，抑制miR-182的表达后，穿过transwell小室的细胞数显著降低(p<0.05)。荧光素酶报告基因系统检测结果说明转染miR-182抑制剂组的相对荧光素酶活力显著升高(p<0.05)。Western blot检测结果显示在细胞中转染miR-182抑制剂48h后，细胞中PFN1蛋白的表达显著上升(p<0.05)