低剂量照射通过上调血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-9的表达促进骨痂微血管新生祖细胞动员而加速骨痂矿化

在已完成低剂量X线全身照射（LDI）大鼠闭合骨折模型发现其促进骨痂矿化、并初步探知机理是LDI促进骨痂微血管新生及骨髓基质细胞动员等相关工作基础上，利用RNA干扰技术，分别建立血管内皮生长因子（VEGF）、 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因沉默的小鼠闭合性骨折模型及干（祖）细胞系，通过在体（动物）和离体（细胞培养）实验结合并且关联验证的实验设计方案，运用细胞转染、分子生物学（RT-PCR、Western-blot、酶标记免疫吸附测定法）、pQCT扫描、MicroCT三维重建、微血管灌注造影、生物力学测试及组织学等多重技术和先进检测手段，来研究低剂量局部照射对骨折愈合过程中祖细胞动员和向成骨细胞、内皮细胞和破骨细胞分化，骨痂矿化、骨痂微血管新生及相关因子（skitL、BMP-2）的影响，明确低剂量X线局部照射通过上调VEGF和MMP-9，促进祖（干）细胞动员和微血管新生，从而加速骨痂矿化

在已完成低剂量X线全身照射（LDI）大鼠闭合骨折模型发现其促进骨痂矿化、并初步探知机理是LDI促进骨痂微血管新生及骨髓基质细胞动员等相关工作基础上，进一步研究低剂量照射对骨折愈合过程中祖细胞动员和向成骨细胞、内皮细胞和破骨细胞分化，骨痂矿化、骨痂微血管新生及相关因子（skitL、BMP-2）的影响，明确VEGF和MMP-9在LDI促进骨折愈合的作用机制。我们发现：LDI促进成骨细胞的增殖和分化，同时上调了成骨细胞相关特异性基因（如BMP-2、Runx2和Col I等）的表达，在一定程度上提高成骨细胞的矿化能力。同时， LDI促进了破骨细胞的分化和成熟，并上调了TRAP、Cathepsin-K和MMP-9等特异性功能基因的表达，提示LDI促进破骨细胞的功能活性。由此可见，LDI在骨折愈合过程中对两种主要功能细胞的协同拮抗作用起到类似酶的效应。后来又重点研究LDI促进骨折愈合的内在信号传导机制。在成骨细胞中观察LDI诱导的DNA-PKcs-mTORC2-AKT通路活化的分子机制，我们进一步发现：低剂量照射（LDI）亦诱导DNA短暂及轻微的损伤，表现为p-H2AX水平（DNA损伤标识）被短暂增加，损伤的DNA进一步致DNA-PKcs磷酸化激活，激活的DNA-PKcs转位到细胞浆内和mTORC2组成蛋白Sin1耦联，两者共同作为“PDK2”诱导AKT Ser-473磷酸化，促进ALP活性，RUNx2和Col I基因表达增加，而AKT特异性抑制剂（Perifosine, MK-2206及LY294002）抑制LDI对成骨细胞分化和增殖的作用。接着研究外源性SCF通过Gai-Gab1街头蛋白复合物激活间充质干细胞AKT信号通路，Gai1/3双敲型及Gab1单敲型小鼠成纤维细胞AKT信号通路被阻断，慢病毒干扰骨髓间充质干细胞Gai1/3基因表达，则阻断SCF激活AKT信号传导，并明显降低SCF诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。明确了Gai-Gab1复合物介导SCF激活AKT信号通路，为进一步探索LDI促进间充质干细胞成骨分化提供新靶点。