标记定量蛋白质组方法学基础研究及其在癌细胞迁移中的应用

本项目针对目前定量蛋白质组质谱分析中由肽段可检测性差异带来的蛋白定量结果系统性偏差问题，在前期基于非标记定量蛋白质组技术的研究基础上，考察我们已建立的线性相关肽段选择原则(ERLPS)在基于标记肽段的定量蛋白质组技术中的可行性；系统深入研究质谱定量的重复性、可转移性、动态范围，以及可能影响定量分析的基质效应、物化属性等因素，以期校正基于标记肽段的蛋白定量和比较结果，并获得更宽的定量线性动态范围，从而优化和指导以大规模筛选生物标志物为目标的定量和比较蛋白质组学质谱实验设计；将基于标记肽段的ERLPS用于准确定量同一来源却具有不同迁移速度的两种肿瘤细胞蛋白质组，从而得到可能影响细胞迁移的蛋白差异表达谱，通过生物信息分析找出影响肿瘤细胞迁移速率的调控网络，分别RNAi抑制和过表达这些关键网络节点蛋白，并进行分子生物学和细胞生物学验证以阐释其内在机理，为癌细胞转移扩散的抑制研究提供理论基础。

在很宽的动态范围内对蛋白质组进行准确定量是将蛋白质组技术应用于生物和医学研究领域的核心问题之一。同一蛋白的不同肽段在同一实验平台下的信号强度随浓度的变化并不相同，这体现了同一蛋白在同一蛋白质组学平台下的可检测性不同。对某一肽段，当样本上样量增加时，在质谱条件不变的情况下，不可能得到无限增长的谱图信号。目前的定量蛋白质组学的基本原理是比较组成目标蛋白的全部或者部分肽段的信号强度的加和，或者单独比较肽段的信号强度后取平均值。不同肽段鉴定信号强度或者比值的差异将会给目标蛋白的定量结果带来先天性的偏差。因此，怎样最大程度上减小因肽段可检测性差异带来的定量偏差成为基于酶切肽段的定量和比较蛋白质组学的关键。. 本项目中，我们针对目前定量蛋白质组质谱分析中由肽段可检测性差异带来的蛋白定量结果系统性偏差问题，在前期基于非标记定量蛋白质组技术的研究基础上，系统考察了各种实验变量对线性相关肽段选择原则(ERLPS)的影响，包括不同的质谱系统，不同的样本复杂程度，不同样本准备过程（溶液酶切/胶上酶切），不同的分离梯度，不同的上样量范围等。实验结果显示，ERLPS在合适的动态范围内具有良好的的重复性、可转移性，应该针对特定的实验选择线性相关性肽段。我们尝试将ERLPS应用到实际的比较蛋白质组学中。细胞迁移竞争实验筛选的不同迁移速度的乳腺癌细胞系在传代培养3~5代后，其迁移速率差异特性会退化，因此，蛋白样本的收集过程比较长。我们考虑用其它生物学模型来验证定量蛋白质组方法的结果。我们分别用O18/O16和SILAC重轻标标记并梯度混合酵母、人293T、C57小鼠鼠肝酶切肽段，考察我们已建立的线性相关肽段选择原则(ERLPS)用于O18/O16标记和SILAC标记的标记定量蛋白质组实验中，证实了在基于标记肽段的定量蛋白质组技术中的可行性。通过上述系统深入的研究质谱定量重复性、可转移性、动态范围，以及可能影响定量分析的基质效应、物化属性等因素，从而为优化和指导以大规模筛选生物标志物为目标的定量和比较蛋白质组学质谱实验设计奠定了方法学基础。上述工作已发表在Proteomics, 2014 Jul;14(13-14):1593-603. doi: 10.1002/pmic.201300032（见结题报告附件）